一种脂肪干细胞-生物材料复合物冻存液及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种脂肪干细胞-生物材料复合物冻存液，所述的冻存液中含有：0.2-0.8mol/L海藻糖；和10-40%促红细胞生成素。本发明还公开了一种脂肪干细胞-脱钙骨复合物的处理方法，并提示通过本发明提供的方法处理的脂肪干细胞-脱钙骨复合物经过检测其细胞存活率和活力都保持在较高的水平，且动物体内回植实验结果显示经该方法冻存的细胞-脱钙骨复合物仍能得到很好的修复效果，为临床应用打下基础。
【专利说明】一种脂肪干细胞-生物材料复合物冻存液及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术，尤其涉及脂肪干细胞-脱钙骨复合物冻存液和脂肪干细胞-脱钙骨复合物的处理方法。
【背景技术】
[0002]传统深低温冻存要求精确的降温速率控制，操作复杂，但仍无法避免在降温过程中出现冰晶对细胞造成伤害。玻璃化冻存方法很好地解决了这个问题。在玻璃化过程中，物质并不结晶，而是形成一种超冷冻液体，外观接近固体，但仍保持着作为液体特征的分子无序性。细胞或组织在玻璃化过程中受到的损伤降到了最小。
[0003]脂肪来源干细胞有较强的增殖及成骨能力，且采集时对病人造成的创伤较小，临床应用潜能较大。组织工程骨构建技术与玻璃化冻存的结合为临床应用提供了更大的便利性和更多的选择性。
[0004]因此本领域迫切需要提供简便而有效地冻存以脂肪来源干细胞为种子细胞的种子细胞-生物材料复合物的方法。
【发明内容】
[0005]本发明旨在提供一种脂肪干细胞-脱钙骨复合物的冻存液。
[0006]本发明的另一个目的是提供一种如上述的脂肪干细胞-脱钙骨复合物的冻存液的用途。
[0007]本发明的再一个目的是提供一种脂肪干细胞-脱钙骨复合物的处理方法。
[0008]在本发明的第一方面，提供了一种脂肪干细胞-脱钙骨复合物冻存液，所述的冻存液中含有:0.2-0.8mol/L海藻糖；和10-40m/v%促红细胞生成素。
[0009]在另一优选例中，所述的冻存液中含有:0.4-0.8mol/L海藻糖；和20_38m/V%促红细胞生成素。
[0010]更佳地，所述的冻存液中含有:0.6-0.8mol/L海藻糖；和25_35m/V%促红细胞生成素。
[0011 ] 在另一优选例中，所述冻存液含有余量的无血清DMEM培养液。
[0012]最佳地，所述冻存液含有0.8mol/L海藻糖，30m/v%促红细胞生成素和余量的无血清DMEM培养液。
[0013]在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的冻存液的用途，所述的冻存液可用于保存脂肪干细胞-脱钙骨复合物。
[0014]在本发明的第三方面，提供了一种脂肪干细胞-脱钙骨复合物的处理方法，所述的方法包括步骤:
[0015](I)将脂肪干细胞接种脱钙骨，使用成骨诱导液诱导培养；
[0016](2)将步骤(1)得到的脂肪干细胞-脱钙骨复合物和如上所述的本发明提供的冻存液混合；和[0017](3)将与冻存液混合的脂肪干细胞-脱钙骨复合物在液氮中冻存，得到冷冻保存的脂肪干细胞-脱钙骨复合物。
[0018]在另一优选例中，所述方法还包括步骤:
[0019](4)将冷冻保存的脂肪干细胞-脱钙骨复合物在40 - 80°C水浴复温。
[0020]更佳地，复温3 — 8天，最佳地为4 — 6天。
[0021]据此，本发明提供了简便而有效地冻存以脂肪来源干细胞为种子细胞的种子细胞-生物材料复合物的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1显示了不同组分冻存液冻存后细胞存活率变化。
[0023]图2显示了不同组分冻存液冻存后碱性磷酸酶活性变化。
[0024]图3显示了不同组分冻存液冻存后骨钙素分泌变化。
[0025]图4显示了 Design -expert (软件名称,用于实验设计,为本领域并不限于本领域的公认顶级实验设计软件，美国Stat-Ease，Inc公司产品)运行多响应优化结果，即分类因素水平的16个组合的结果。
[0026]图5显示了复苏后细胞生长曲线。
[0027]图6显示了复苏后碱性磷酸酶活性。
[0028]图7显示了冻存与未冻存的细胞-支架复合物对骨修复效果相同。
【具体实施方式】
[0029]发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现了一种脂肪干细胞-脱钙骨复合物的冷冻保存液，它可以长久而有效地保持脂肪干细胞-脱钙骨复合物中脂肪干细胞的存活率、及其细胞功能。另外，发明人针对多个优化目标，采用期望函数(The desirabilityfunction)的多响应优化方法，将每个响应转换成期望函数，并求得期望函数的几何平均值即为最终的响应目标。
[0030]具体地，发明人发现可以将脂肪干细胞-脱钙骨复合物和含有海藻糖和促红细胞生成素的溶液混合后，进行冻存。
[0031]如本文所用，“促红细胞生成素(erythropoietin; erythrogenin;ΕΡ0) ”是指在哺乳动物肾脏和肝脏产生的一种分子质量为46kDa的糖蛋白细胞因子；能刺激幼稚红细胞的增生，血红蛋白化和红细胞的成熟。
[0032]如本文所用，“脂肪干细胞(Adipose derived stem cells,ADSCs) ”是指从脂肪组织中得到的具有增殖分化能力的干细胞。更佳地，指同时具有多向分化能力的脂肪干细胞。
[0033]所述脂肪干细胞可以来自同种同体、同种异体、异种异体，优选来自同种的脂肪干细胞。本发明优选人脂肪干细胞。
[0034]可以使用本领域熟知的方法获得脂肪干细胞，例如但不限于，所述的方法包括步骤:a、人脂肪抽吸物用I型胶原酶消化；b、离心弃上清，有核细胞接种；和c、加入DMEM培养液，培养、传代。
[0035]如本文所用，“医学上可接受的生物可降解材料”、“支架材料”、或“生物材料”可以互换使用，包括(但并不限于):[0036](a)人工合成的高分子可降解性材料，例如聚α _羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸 PGA、聚羟基丁酸 PHB 等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烧(poIyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚环氧乙烧、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；
[0037](b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan, GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸|丐凝胶等；各种脱细胞基质；
[0038](C)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料。
[0039]如本文所用，“成骨诱导”是指体外培养的ADSCs在成骨诱导条件下，表达成骨细胞表型。
[0040]本发明所用术语“成骨细胞”和“骨细胞”可互换使用。
[0041]如本文所用，“m/v”或“m/v%”是指质量体积比，单位可以是克/100ml。
[0042]冻存液
[0043]本发明提供的脂肪干细胞-生物材料复合物的冻存液中含有海藻糖和促红细胞生成素，优选含有余量的无血清DMEM培养液。
[0044]所述冻存液中海藻糖的浓度为0.2-0.8mol/L，促红细胞生成素的浓度为10_40% ；优选海藻糖的浓度为0.4-0.8mol/L，促红细胞生成素的浓度为20-38m/v% ;更优选海藻糖的浓度为0.6-0.8mol/L，促红细胞生成素的浓度为25-35m/v% ;最优选海藻糖的浓度为
0.8mol/L，促红细胞生成素的浓度为30m/v%。其中的体积百分比是以冻存液的总体积计。
[0045]脂肪干细胞-生物材料复合物的冻存和复苏
[0046]可以使用本领域熟知的方法获得脂肪干细胞-生物材料复合物，例如但不限于，将传代脂肪干细胞接种于生物材料上，然后使用成骨诱导液诱导培养。
[0047]本发明中ADSCs-生物材料复合物的细胞接种浓度通常约为2X IOVml至7X IO7/ml或更高。材料优选固体性材料，以培养液调整细胞浓度，然后与固体性材料混合，其中混合时培养液与固体性材料的比例没有特别限制，但是以该固体材料所能够吸附培养液的最大量为准。
[0048]所述的成骨诱导液是本领域中熟知的。优选在培养液中加入地塞米松、维生素D3与β_磷酸甘油。合适的培养液包括(但并不限于):1)F-12培养基+10%胎牛血清；2)F-12培养基+20%小牛血清；3)F-12培养基+10-20%自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子、各种转基因成分和各种细胞成分。
[0049]将经过成骨诱导培养的细胞-生物材料复合物(为脂肪干细胞与诱导的成骨细胞并存)浸入本发明提供的冻存液中(浸没)，在冰上孵育10 - 20分钟后直接投入液氮冻存，得到冷冻保存的细胞-生物材料复合物。 [0050]将冷冻保存的细胞-生物材料复合物在40 - 800C (优选50 — 70°C )快速融化使
其复苏。
[0051]本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0052]本发明的主要优点在于:
[0053]1、本发明提供的细胞-生物材料复合物冻存液可以使冻存的细胞-生物材料复合物中的细胞存活率高。
[0054]2、本发明提供的细胞-生物材料复合物冻存液可以使冻存的细胞-生物材料复合物中的细胞活力高。
[0055]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
[0056]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0057]本发明实施例中的主要物质的来源为:
[0058]
【权利要求】
1.一种脂肪干细胞-脱钙骨复合物冻存液，其特征在于，所述的冻存液中含有: 0.2-0.8mol/L 海藻糖；和 10-40m/v%促红细胞生成素。
2.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述的冻存液中含有: 0.4-0.8mol/L 海藻糖；和 20-38m/v%促红细胞生成素。
3.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述的冻存液中含有: 0.6-0.8mol/L 海藻糖；和 25-35m/v%促红细胞生成素。
4.如权利要求1-3任一所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液含有余量的无血清DMHM培养液。
5.如权利要求4所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液含有0.8mol/L海藻糖，30m/v%促红细胞生成素和余量的无血清DMEM培养液。
6.—种如权利 要求1-5任一所述的冻存液的用途,其特征在于,所述的冻存液可用于保存脂肪干细胞-脱钙骨复合物。
7.一种脂肪干细胞-脱钙骨复合物的处理方法，其特征在于，所述的方法包括步骤: (1)将脂肪干细胞接种脱钙骨，使用成骨诱导液诱导培养； (2)将步骤(1)得到的脂肪干细胞-脱钙骨复合物和如权利要求1-5任一所述的冻存液混合；和 (3)将与冻存液混合的脂肪干细胞-脱钙骨复合物在液氮中冻存，得到冷冻保存的脂肪干细胞-脱钙骨复合物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤: (4)将冷冻保存的脂肪干细胞-脱钙骨复合物在40- 80°C水浴复温。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，复温3— 8天；优选4 一 6天。
【文档编号】A01N1/02GK104012519SQ201310063006
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2013年2月28日 优先权日:2013年2月28日
【发明者】戴建英, 刘占杰, 张泽宇, 俞铁锋 申请人:杭州启迪生物科技有限公司