专利名称：菊花bHLH转录因子CmbHLH1基因及其植物表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因及其植物表达载体和应用。
背景技术：
植物转录因子在植物的生长发育过程中起着重要作用，转录调控过程的研究已成为当今分子生物学的研究重点。bHLH转录因子是植物中第二大类转录因子家族，该家族成员在调控一系列重要的生理过程中发挥着重要作用，例如，调节植物根毛的形成、种子与芽的形态发生、光的形态建成以及植物对激素和外界环境因子响应的反应[I 5].
菊花(Chrysanthemum morifolium)是我国十大传统名花和世界四大切花之一,极具观赏价值与经济价值。干旱、盐碱、冻害、病害等胁迫以及栽培土壤中自身营养元素的缺乏是导致菊花品质下降、生产产品不符合标准以及限制其园林应用的主要影响因子。目前，菊花抗逆性育种多依赖于传统的杂交育种，其过程缓慢、耗费人力并且具有不定向性，杂交后代往往不能够符合育种要求。 目前，菊花转录因子的研究还仅限于DREB转录因子、MYB转录因子等少数类型的转录因子[6_8]，还有许多关键的调控转录因子没有被发掘和利用，这严重制约着菊花分子遗传改良及其新品种的选育。鉴于bHLH转录因子在植物生长发育过程中发挥着重要调控作用，控制着一系列重要的生理生化过程，因而对该类转录因子的分子机理研究具有十分重要的意义，对于菊花新品种的选育也具有指导作用。在基因工程育种过程中，通常选用农杆菌介导法将外源基因导入到植物细胞中，其中最关键的就是植物表达载体的构建。将转录因子基因构建植物表达载体，并用农杆菌介导法进行植物遗传转化，使转录因子在CaMV35S启动子的启动下超量表达，达到调控下游目的基因的目的，对于充分发挥该基因的功能、新品种的选育及在生产中的广泛应用都具有深远意义。[l]Yi, K., Menand, B., Bell, E., and Dolan, L.A basic helix - loop - helixtranscription factor controls cell growth and size in root hairs.Naturegenetics.2010，42:264 - 267.
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发明内容
针对背景技术提出的解决提高菊花矿质元素吸收的问题，提供一种新的菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因。本发明的另一目的在于该转录因子CmbHLHl基因的植物表达载体。本发明的又一目的是提供该基因的应用。本发明的目的可以通过以下技术方案实现:菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因，该基因的序列为SEQ ID N0.1。菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因的植物表达载体，由本发明所述的菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因(序列为SEQ ID N0.1)与中间植物表达载体pCAMBIA1301构成。上述的菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因的植物表达载体，是由BamH I和Sac I双酶切CmbHLHl后插入到pCAMBIA1301表达载体质粒进行连接反应得到。菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因植物表达载体，其构建方法如下:I)菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因的克隆以提取的菊花‘钟山紫桂’幼嫩叶片为材料，提取总RNA并反转录为cDNA，设计引物扩增 CmbHLHl 基因，上游引 物 CmbHLHl -F: 5' -GTCTTACGAGAACAACA - 3' (SEQ ID N0.2)下游引物CmbHLHl - R:5/ - TTAAGTTCTAAGGAGACA - 3' (SEQ ID N0.3)以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19 -T Simple载体，转化DH5a感受态细胞，测定的序列为SEQ ID N0.1。2)植物表达载体 pCAMBIA1301 -(+/-)- CmbHLHl 的构建设计引物以菊花‘钟山紫桂’cDNA为模板，利用PCR反应在CmbHLHl基因的上游和下游分别引入BamH I和Sac I酶切位点(下划线所示)，反应要求高保真酶进行。
CmbHLHl - Sense - F:5/ - GCGGATCCATGGTTTCACCGGAGA - 3' (SEQ ID N0.4)BamH ICmbHLHl - Sense - R:5/ - TCGAGCTCTTAGGCAACAGGAGG - 3' (SEQ ID N0.5)Sac ICmbHLHl - Antisense - F:5/ - GCGGATCCAATCCGTTGTCCTCC - 3' (SEQ ID N0.6)BamH ICmbHLHl - Antisense - R:5/ - TCGAGCTCTACCAAAGTGGCCTCT - 3' (SEQ ID N0.7)Sac I将PCR产物连接到pMD19 - T Simple载体，转化DH5 α感受态细胞，提取阳性质粒，用BamH I和Sac I双酶切含有CmbHLHl的T载体与pCAMBIA1301载体，选择所需片段进行连接，转化，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为SEQ ID N0.1，植物表达载体PCAMBIA1301 -(+/-)- CmbHLHl 构建成功。3) CmbHLHl的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化,提高菊花品种‘神马，的离子吸收能力，方法如下:
农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化菊花品种‘神马’的转化与抗性苗的筛选RT - PCR鉴定及离子吸收能力评价本发明所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，创制高铁离子吸收新种质，可用于植物品种改良。 本发明的有益效果:1.本发明提供的菊花CmbHLHl基因是一个新发现的bHLH转录因子基因，该基因可提高植物的离子吸收能力。2.本发明构建的菊花CmbHLHl基因植物表达载体为首次离子吸收相关bHLH类转录因子的报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创制抗贫瘠土壤新种质，可进行菊花品种改良。
图1为CmbHLHl琼脂糖凝胶电泳分析M:DNA Marker ；1: CmbHLHl图2 为 pCAMBIA1301 -(+/-)- CmbHLHl 表达载体 BamH I 和 Sac I 双酶切检测图M:DNA Marker ；1:正义载体双酶切；2:反义载体双酶切图3为转基因菊花‘神马’的获得图4为野生型与转基因菊花‘神马’表达量分析鉴定WT:野生型；35S:: (+)CmbHLHl -1:转正义载体表达株系 I ;35S:: (+)CmbHLHl -2:转正义载体表达株系2 ；35S:: ( - )CmbHLHl -1:转反义载体表达株系I ;35S::(-)CmbHLHl - 2:转反义载体表达株系2图5为野生型与转基因菊花‘神马’的离子吸收能力评价WT:野生型；35S:: (+)CmbHLHl -1:转正义载体表达株系 I ;35S:: (+)CmbHLHl -2:转正义载体表达株系2 ；35S:: ( - )CmbHLHl -1:转反义载体表达株系I ;35S::(-)CmbHLHl - 2:转反义载体表达株系2图6为植物表达载体pCAMBIA1301 -(+/-)- CmbHLHl的构建策略
具体实施例方式实施例1.CmbHLHl基因的克隆选用菊花‘钟山紫桂’作为材料，取0.1g幼嫩叶片，按照Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书方法，提取叶片总RNA，参照M -MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取I μ g总RNA反转录成cDNA,后用RNase消化cDNA产物,参照菊花EST文库中一序列信息,经primer5软件分析设计引物扩增CmbHLHl ；上游引物CmbHLHl - F:5/ - GTCTTACGAGAACAACA - 3' (SEQ ID N0.2)，下游引物CmbHLHl - R:5/ - TTAAGTTCTAAGGAGACA - 3' (SEQ ID N0.3)，以叶片cDNA为模板，进行PCR反应，50μ I反应体系:10XRCR Buffer5.Ομ I,CmbHLHl - F、CmbHLHl - R 引物各 1.0 μ I (20 μ mol/L), dNTP mix4.0 μ I (2.5mmol/L)，TaqDNA Polymerase0.2 μ 1，cDNA 模板 I μ 1，ddH2037.8 μ I ;反应程序:95°C预变性 5min，然后94°C解链45sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，反应35个循环，72°C延伸IOmin ;用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化PCR产物，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19 -T Simple载体(TaKaRa)，转化DH5a感受态细胞，序列测定为SEQ ID N0.1 (图1);实施例2.植物表达载体pCAMBIA1301 -(+/-)- CmbHLHl的构建(图6)设计引物进行PCR反应，在目的基因CmbHLHl的上游和下游分别引入酶切位点BamH I和Sac I (下划线所 示)，将PCR产物连接到pMD19 - T Simple载体，转化DH5 α感受态细胞，提取阳性质粒，BamH I和Sac I双酶切的CmbHLHl片段与BamH I和Sac I双酶切的pCAMBIA1301载体质粒片段进行连接，转化，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证，(图2)。CmbHLHl - Sense - F:5/ - GCGGATCCATGGTTTCACCGGAGA - 3' (SEQ ID N0.4)BamH ICmbHLHl - Sense - R:5/ - TCGAGCTCTTAGGCAACAGGAGG - 3' (SEQ ID N0.5)Sac ICmbHLHl - Antisense - F:5/ - GCGGATCCAATCCGTTGTCCTCC - 3' (SEQ ID N0.6)BamH ICmbHLHl - Antisense - R:5/ - TCGAGCTCTACCAAAGTGGCCTCT - 3' (SEQ ID N0.7)Sac I①以菊花‘钟山紫桂’叶片cDNA作为模板，用高保真酶(PrimeSTAR HS DNAPolymerase, TaKaRa)进行 PCR 反应，50 μ I 反应体系:10XHS RCR Buffer5.0 μ 1，CmbHLHl -Sense(Antisense)-F 与 CmbHLHl -Sense(Antisense)-R 引物各 1.0 μ I (20 μ mol/I), dNTP mix4.0 μ I (2.5mmol/l), PrimeSTAR HS DNA Polymerase0.4 μ I, cDNA 模板I μ 1，ddH2037.6 μ I ;反应程序:95°C预变性 5min，然后 94°C解链 45sec，55°C退火 30sec,72°C延伸lmin，反应35个循环，72°C延伸IOmin ;用凝胶回收试剂盒(AXYGEN，USA)回收PCR产物，连接到pMD19 - T Simple载体，转化DH5 α感受态细胞，提取阳性质粒pMD19 - TSimple - CmbHLHl (正义或反义 pMD19 - T Simple - CmbHLHl)；
②取pCAMBIA1301 载体和 pMD19 - T Simple - CmbHLHl 质粒用 BamH I 和Sac I 双酶切，双酶切体系(50μ I):10XK Buffer2.5 μ 1，pCAMBIA1301 或 pMD19 - TSimple - CmbHLHllOy 1，BamHI2 μ I, Sac 12 μ 1，ddH2033.5 μ I ;37°C 反应 2.5h ;双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pCAMBIA1301大片段和pMD19 - T Simple - CmbHLHl小片段。用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接两个回收的产物，连接反应体系(10 μ I):10XT4 ligase Buffer I μ 1，pCAMBIA1301 大片段 2 μ I,pMD19 - T Simple - CmbHLHl小片段6 μ 1，T4 DNA连接酶I μ I ;16 °C过夜连接反应，取5 μ I连接产物转化DH5a感受态细胞。37 1:过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒PCAMBIA1301 - (+/-)- CmbHLHl，电泳和测序验证含SEQ ID N0.1。植物表达载体PCAMBIA1301 -(+/-)- CmbHLHl 的构建成功(图 2)。实施例3.植物表达载体pCAMBIA1301 -(+/-)- CmbHLHl遗传转化菊花‘神马’及其离子吸收能力鉴定①农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化从YEB (50 μ g/ml利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50ml含50 μ g/ml利福平的YEB液体培养基中，200 rpm, 28°C培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30 min,离心收集菌体，悬浮于2 ml预冷的的IOOmM CaCl2 (20%甘油)溶液中，200 μ I/管分装，待用。取10 μ I pCAMBIA1301 -(+/-)- CmbHLHl 载体质粒，加入 200 μ I 感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37°C 5min,加入800 μ I YEB液体培养基，28°C 200rpm预培养4h,菌液涂板于ΥΕΒ(50 μ g/ml利福平+50 μ g/ml卡那霉素)固体培养基上，28°C暗培养2d，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，培养到OD为0.5 0.6时，用于叶盘法转化。②叶盘法转化菊花取组培瓶中‘神马’苗顶端叶盘(0.5cmX0.5cm)作为转化受体，在预培养培养基中预培养2 3d,然后浸入备好的农杆菌菌液(0D为0.5 0.6)中感染8min,用滤纸吸干叶盘表面的菌液后再接种到共培养基上黑暗中培养3d，然后转入筛选培养基上继代培养3 4代，两周继代一次，逐渐降低筛选压，等分化出的抗性芽长至2 3cm时，将抗性芽转入生根筛选培养基上进行筛选，初步获得抗性植株，抗性植株生根筛选后得到的抗性苗(图3)。③CmbHLHl基因表达量鉴定及离子吸收能力评价待抗性芽成为幼苗后，选取幼嫩叶片提取总RNA并反转录为cDNA。根据CmbHLHl基因的cDNA全长序列设计引物实时定量分析引物CmbHLHl - RT - F和CmbHLHl - RT - R。弓丨物序列分别如下:CmbHLHl - RT - F: 5' - GCCAAACAATGGGCAATA -3' (SEQ ID N0.8)CmbHLHl - RT - R: 5' - TACAGGAGGGCGAAGCA - 3' (SEQ ID N0.9)按照突光定量试剂盒(SYBfTGreen Realtime PCR Master Mix - Plus - (QPK-212)说明书建立 25 μ I 反应体系:SYBR* Green Realtime PCR Master Mix -Plus 12.5 μ 1，Plus Solution 2.5 μ 1，CmbHLHl -RT -F(IOyM)LOy I, CmbHLHl - RT - R(IOyM)LOy I,cDNAl.Ομ I, ddH207.0 μ I。将 PCR 管置于 Rotor -Gene3000PCR 仪的 36 孔转轮中，按照以下反应程序进行PCR反应:95° Clmin ；95° C15s，55° C15s，72° C40s，40个循环。每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，以Oh时未处理的根中的表达为基准值，通过公式相对表达量=2_ΛΛετ计算不同处理时间点的基因相对表达情况，其中:
ΔΔ CT= (CT, Target - CT, GAPDH) Time χ - (CT, Target - CT, GAPDH) TimeO。基因表达量分析鉴定表明转正义载体表达株系的表达量最高约为野生型的2倍，转反义载体表达株系的表达量最低约为野生型的1/3 (图4)。以非转基因‘神马’为对照，对野生型CmbHLHl基因表达量差异较大的4个转基因株系在MS培养基上扩繁。待生根后，将小苗取出并水培一天以使幼苗适应。将每个株系的小苗平均分为两组以进行缺铁离子胁迫。将小苗放入出去铁离子并加入铁离子螯合剂菲洛嗪的MS培养液中经行水培并以MS完全培养液为对照。处理3天后，分别对各组根部取样，经过硝解后用0ptimal2100DV电感稱合等离子体发射光谱仪(Perkin Elmer)进行金属离子的含量变化，尤其是铁离子的含量变化，发现转正义基因菊花‘神马’(35S::(+)CmbHLHl -1,35S:: (+)CmbHLHl -2)中根部铁离子的含量明显高于非转基因株系与低表达该基因的株系(图5)。综上所述，本发明构 建了含有bHLH转录因子CmbHLHl的植物表达载体PCAMBIA1301 -(+/-) -CmbHLHl，其中CmbHLHl为首次报道。所构建的载体可导入菊花中，提高菊花对铁离子的吸收。
权利要求
1.菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因，其特征在于该基因的序列为SEQID N0.1。
2.含菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因的植物表达载体，其特征在于由权利要求1所述的菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因与植物表达载体构成。
3.根据权利要求2所述的含菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因的植物表达载体，其特征在于所述的植物表达载体是将CmbHLHl基因插入pCAMBIA1301表达载体的BamH I和Sac I酶切位点所得。
4.权利要求2或3所述的菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因植物表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤: 1)菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因的克隆 设计引物以菊花‘钟山紫桂’ cDNA为模板，利用PCR反应扩增上、下游分别含BamHI和Sac I酶切位点的CmbHLHl基因；其中使用的引物序列为=CmbHLHl-Sense-F:SEQ ID N0.4，CmbHLHl-Sense-R:SEQ ID N0.5，CmbHLHl-Antisense-F:SEQ ID N0.6,CmbHLHl-Antisense-R:SEQ ID N0.7 ； 2)植物表达载体pCAMBIA1301-(+/-)-CmbHLHl的构建 将PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化DH5a感受态细胞，提取阳性质粒，BamH I和Sac I双酶切的CmbHLHl片段与BamH I和Sac I双酶切的pCAMBIA1301载体片段连接，转化，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为SEQ ID N0.1，植物表达载体PCAMBIA1301- (+/-) -CmbHLHl 构建成功。
5.权利要求1所述的菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因在菊花品种改良中的应用。
6.根据权利要求5 所 述的应用，其特征在于所述的菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因在创制高铁离子吸收菊花新种质中的应用。
7.权利要求2所述的含菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因的植物表达载体在菊花品种改良中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的含菊花bHLH转录因子CmbHLHl基因的植物表达载体在创制高铁离子吸收菊花新种质中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，涉及菊花bHLH转录因子CmbHLH1基因及其植物表达载体和应用。本发明菊花bHLH转录因子CmbHLH1基因序列如SEQ ID NO.1所示，所构建的表达载体pCAMBIA1301‐(+/‐)‐CmbHLH1是将CmbHLH1基因插入到克隆载体pMD19‐T simple vector(Takara)，后经过BamH I(Takara)和Sac I(Takara)双酶切后连接到表达载体pCAMBIA1301的BamH I和Sac I位点得到的。将该植物表达载体用于植物遗传转化，正反义CmbHLH1基因在CaMV35S启动子的启动下过量表达，从而达到影响下游目的基因的表达效果，提高植物铁离子的吸收能力并进一步验证该基因的功能。菊属中该基因是首次发现与铁离子吸收相关的bHLH转录因子。
文档编号A01H5/00GK103146712SQ20131009656
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月22日 优先权日2013年3月22日
发明者陈发棣, 赵民, 蒋甲福, 陈素梅, 李佩玲, 宋爱萍, 房伟民 申请人:南京农业大学