专利名称：具有抗植物病原菌作用的银杏内生真菌抗菌发酵液的制备方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，涉及一种发酵培养方法，具体涉及银杏内生真菌的抗菌发酵液的制备方法。
背景技术：
农业生产过程中，大量使用化学农药引起一系列环境和健康问题已被人广泛认知，研制安全、高效、环保的新型农药已成为发展的方向和研究的主题。微生物农药因对环境友好，不易产生抗性，生产成本低，发酵工艺简单，对非靶标生物安全等优点，成为新型农药发展的热点和重点。作为重要的药源之一的植物内生真菌(Endophytic fungi)，在与宿主植物长期相互作用、协同进化的·过程中，在植物体内维持了微生态系统平衡。为了保持这种平衡，植物内生真菌可能产生与宿主植物相同或相似功能的次生代谢产物。因此,可将植物内生真菌的次生代谢产物作为新化合物、新药物筛选的潜在或替代资源，从而有效降低新药物或其它用途活性物质的研发成本。银杏{Ginkgo biloba L.)素有裸子植物“活化石”和“植物界熊猫”之称，是中国特有的珍贵树种，在漫长的生长期中几乎不感染病虫害，寿命极长。根据植物内生真菌内共生理论推断，银杏中很有可能存在着某些内生真菌，通过产生具有特殊抗菌活性的次生代谢产物，影响宿主银杏的抗病害能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对植物病原真菌的菌丝生长具有较好抑制作用的银杏内生真菌抗菌发酵液的制备方法。本发明所述的银杏内生真菌命名为腐皮镰孢T-7 Q7UsariUm solani T-7),现保藏在国家知识产权局指定的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC N0.5089。本发明的银杏内生真菌系从中国安徽省合肥市银杏biloba L)植物活体中分离得到。抗菌发酵液的具体制备方法如下:
所述抗菌发酵液的具体制备操作步骤如下:
(1)菌种活化
在无菌条件下，用接种环挑取少许保藏的银杏内生真菌的菌种，转接于已灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中，恒温避光培养5天，培养温度28°C 土 TC，得到活化菌种；
(2)种子培养
无菌条件下，利用接种环挑取3环活化菌种，接种于50ml的马铃薯葡萄糖液体培养基内，恒温摇床培养2天，摇床转速160转/分，温度28°C ±1°C，得到一级种子；将一级种子，以10%接种量，接种于50ml的液体培养基中，恒温摇床培养2天，摇床转速160转/分，温度28°C ± I°C，得到二级种子；
(3)发酵培养
将二级种子接种到50ml的液体培养基中，接种量10%，恒温摇床培养7天，摇床转速160转/分，温度28°C ±1°C，得到银杏内生真菌发酵液；发酵液过滤除去菌丝体，无菌条件下，过0.22微米过滤器，即得到银杏内生真菌T-7的抗菌发酵液。发酵培养特征:培养第I天，菌体为少量淡粉色的粉末；培养第3天，淡粉色的细粉末减少，出现粉色的小菌丝球；培养第5天，粉红色菌丝球继续增多，体积变大，发酵液为橙红色；培养第7天，出现大量红色的菌丝球，体积变大，发酵液为橙红色。所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基:马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂18克、蒸馏水I升。所述马铃薯葡萄糖液体培养基的制备:马铃薯200克，葡萄糖20克、蒸馏水I升，pH自然。所述液体培养基:蛋白胨15克，葡萄糖20克，硝酸钠I克，氯化钙0.5克，硫酸镁
0.1克，磷酸氢二钾0.1克，蒸馏水I升，pH自然。上述三种培养基使用前在温度121°C、压力0.1MPa下，灭菌30 min。本发明通过银杏内生真菌T-7的抗菌发酵液的抗菌试验发现，该菌对供试5种植物病原真菌(番爺枯萎病菌(Fusarium oxysporum),苹果腐烂病菌ΓCytosporamandshurica),苹果炭 疽病菌gloeosporioides),梨黑星病菌(Yonturiapirina)，小麦赤霉病菌graminearum))的菌丝生长具有较为明显的抑制作用。本发明以植物内生真菌作为资源，以求获得抗植物病原真菌病害的新型农用抗生素类天然活性物。
具体实施例方式本发明所述银杏内生真菌T-7内生真菌抗植物病原菌发酵液的抗菌试验如下:
1.植物病原真菌:
辣椒疫霉病菌{Phytoph thora capsici ),番爺枯萎病菌 ifusarium oxysporum),苹果腐烂病菌(Pytospora mandshuri ca),苹果炭疽病 HCo I Ietotrichumgloeospori oi des),梨黑星病菌 iyenturia pirina),小麦赤霉病 1^iFusariumgraminearum )；
2.病原微生物的培养
取植物病原真菌的斜面培养物分别接入马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板活化，在(28±1) °C恒温箱中培养5天。3.内生真菌的培养:
本实施例所用银杏内生真菌命名为腐皮镰孢T-7 Q7UsariUm solani T_7),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC N0.5089 ；
在无菌条件下，用接种环挑取少许银杏内生真菌的菌种，转接于已灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中，恒温避光培养5天，培养温度28°C ±1°C，得到活化菌种。
4.T-7菌株发酵液制备
无菌条件下，利用接种环挑取3环活化菌种，接种于50ml的马铃薯葡萄糖液体培养基内，恒温摇床培养2天，摇床转速160转/分，温度28°C 土 1°C，得到一级种子；将一级种子，以10%接种量，接种于50ml的液体培养基中，恒温摇床培养2天，摇床转速160转/分，温度28°C ± I°C，得到二级种子； 将二级种子接种到50ml的液体培养基中，接种量10%，恒温摇床培养7天，摇床转速160转/分，温度28°C ± I°C，得到银杏内生真菌发酵液；发酵液过滤除去菌丝体，无菌条件下，过0.22微米过滤器，即得到银杏内生真菌T-7的抗菌发酵液；
发酵培养特征:培养第I天，菌体为少量淡粉色的粉末；培养第3天，淡粉色的细粉末减少，出现粉色的小菌丝球；培养第5天，粉红色菌丝球继续增多，体积变大，发酵液为橙红色；培养第7天，出现大量红色的菌丝球，体积变大，银杏内生真菌T-7的抗菌发酵液为橙红色；
上述马铃薯葡萄糖液体培养基的制备:马铃薯200克，葡萄糖20克、蒸馏水I升，pH自
然；
上述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基:马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂18克、蒸馏水I
升;
上述液体培养基:蛋白胨15克，葡萄糖20克，硝酸钠I克，氯化钙0.5克，硫酸镁0.1克，磷酸氢二钾0.1克，蒸馏水I升，PH自然；
上述三种培养基使用前在温度121°C、压力0.1MPa下，灭菌30 min。5.抑制菌丝生长速率法测定抗菌活性
无菌条件下，在100毫升三角瓶中加入6毫升本发明制备的银杏内生真菌抗菌发酵液和54毫升马铃薯葡萄糖琼脂无菌融化的培养基，摇匀，分别取10毫升置于直径为9厘米无菌培养皿内制成平板，待冷却后在每个培养基平面上接入I个供试病原菌菌饼(直径5毫米)，菌饼的菌丝面贴在培养基表面，将平板置于28±1°C避光培养72小时。采用十字交叉法测定菌落生长直径，用下述公式计算抑制率:
S幺生长- +垄( )= 一..—一总、100
表1:本发明所述的菌株T-7发酵物对六种植物病原微生物的抗菌结果....................................................................................................................................................................................................................................................................................—(%>...........................................................................................................................1Mtfsnmr τ-7觀纪廳應瞧_丨 麵酬
c 雌誦1#>................................................................1jBios............................................................................................................................................................................................................................一..........................................7jfeaj3...................................................................................................mjmrn................................................1iiailgr.................................................4涵9....................................................................................................1tmuM——...............................................................................................................................0ma..................................................................................................1OMi1...............................................由表I可见，腐皮镰孢T-7发酵原液对苹果腐烂病菌(Cytospora mandshuri ca)菌丝生长抑制率达到85%以上，对梨黑星病菌(Venturia pirina)的菌丝生长抑制率在35%以上，对小麦赤霉病菌(/^sari應《raffiifleara )、番爺枯萎病菌 ifusarium oxysporum)、尊果炭疽病菌應Woeo1S^orioiofe1S)的菌丝生长也具有一定的抑制作用。由此可见,本发明制备所得到的银杏内生真菌内生真菌腐皮镰孢T-7发酵物对供试植物病原真菌具有明显的抗菌活性，可以将其选作内生真菌资源，通过发酵制备，以求获得抗植物病原真菌病害的具备新型 农用活性的天然成分。
权利要求
1.具有抗植物病原菌作用的银杏内生真菌抗菌发酵液的制备方法，其特征在于:所述银杏内生真菌命名为腐皮镰孢T-7 Q7UsariUm solani T-7),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC N0.5089 ；所述抗菌发酵液的具体制备操作步骤如下: (1)菌种活化 在无菌条件下，用接种环挑取少许保藏的银杏内生真菌的菌种，转接于已灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中，恒温避光培养5天，培养温度28°C 土 TC，得到活化菌种； (2)种子培养 无菌条件下，利用接种环挑取3环活化菌种，接种于50ml的马铃薯葡萄糖液体培养基内，恒温摇床培养2天，摇床转速160转/分，温度28°C ±1°C，得到一级种子；将一级种子，以10%接种量，接种于50ml的液体培养基中，恒温摇床培养2天，摇床转速160转/分，温度28°C ± I°C，得到二级种子； (3)发酵培养 将二级种子接种到50ml的液体培养基中，接种量10%，恒温摇床培养7天，摇床转速160转/分，温度28°C ±1°C，得到银杏内生真菌发酵液；发酵液过滤除去菌丝体，无菌条件下，过0.22微米过滤器，即得到银杏内生真菌T-7的抗菌发酵液； 发酵培养特征:培养第I天，菌体为少量淡粉色的粉末；培养第3天，淡粉色的细粉末减少，出现粉色的小菌丝球；培养第5天，粉红色菌丝球继续增多，体积变大，发酵液为橙红色；培养第7天，出现大量红色的菌丝球，体积变大，银杏内生真菌T-7的抗菌发酵液为橙红色； 所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基:马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂18克、蒸馏水I升; 所述马铃薯葡萄糖液体培养基的制备:马铃薯200克，葡萄糖20克、蒸馏水I升，pH自然； 所述液体培养基:蛋白胨15克，葡萄糖20克，硝酸钠I克，氯化钙0.5克，硫酸镁0.1克，磷酸氢二钾0.1克，蒸馏水I升，PH自然； 上述三种培养基使用前在温度121°C、压力0.1MPa下，灭菌30 min。
全文摘要
本发明涉及具有抗植物病原菌作用的银杏内生真菌抗菌发酵液的制备方法，所述银杏内生真菌命名为腐皮镰孢T-7，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC No.5089。所述抗菌发酵液的具体制备操作步骤如下(1)菌种活化，(2)一级、二级种子培养，(3)发酵培养，所得发酵液为橙红色。抗菌试验发现本发明的银杏内生真菌T-7的抗菌发酵液对供试的5种植物病原真菌(番茄枯萎病菌，苹果腐烂病菌，苹果炭疽病菌，梨黑星病菌，小麦赤霉病菌)的菌丝生长具有较为明显的抑制作用。本发明以植物内生真菌作为资源，以求获得抗植物病原真菌病害的新型农用抗生素类天然活性物。
文档编号A01N63/04GK103194490SQ20131009745
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月26日 优先权日2013年3月26日
发明者花日茂, 柏钰, 操海群, 吴祥为, 徐庆庆, 曾现银 申请人:安徽农业大学