水稻叶色控制基因OscpSRP54及其编码的蛋白质的制作方法
【专利摘要】本发明公开了水稻叶色控制基因OscpSRP54编码区的cDNA序列SEQIDNo.1及其编码蛋白氨基酸序列SEQIDNo.2。本发明通过图位克隆技术从水稻淡绿叶突变体HM14中克隆控制水稻叶色的基因OscpSRP54,功能互补实验证明OscpSRP54是控制水稻叶色的基因。叶绿体透射电镜观察证明本发明克隆的基因具有调控叶绿体发育，进而控制叶色的功能。可利用该基因调控水稻叶绿体发育，提高光合作用效率，增加水稻产量。本发明的叶色控制基因还可作为基因转化植株后代的追踪标记和杂交制种过程中真杂种的指示标记，应用于良种繁育和杂交育种。
【专利说明】水稻叶色控制基因0scpSRP54及其编码的蛋白质
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种利用图位克隆技术克隆的水稻0scpSRP54基因，可利用该基因调控水稻叶绿体发育，提高光合作用效率，增加水稻产量。本发明的叶色控制基因还可作为基因转化植株后代的追踪标记和杂交制种过程中真杂种的指示标记。
【背景技术】
[0002]水稻是世界上和我国重要的粮食作物，全球有35亿人，我国有60%以上的人口以稻米为主食。为确保粮食安全，我国于1996年启动了超级稻发展计划。叶片光合作用效率是决定水稻产量的重要因子，而光合作用的高效依赖于叶绿素的合成和叶绿体的正常发育，叶绿体不但是植物光合作用而且也是许多重要化合物代谢的场所，因此对叶绿体的发育过程的研究具有重要意义。
[0003]高等植物叶绿体基因组编码大约100个蛋白质，而水稻叶绿体中含有近4800个蛋白、酶和多肽。因此，绝大多数的叶绿体蛋白是由核基因编码的，在细胞质中翻译后运输到叶绿体中。叶色突变体是指叶片发育过程中叶色表型明显异于正常野生型叶色的一类突变体，这类突变体往往表现为叶绿素含量降低，叶绿体发育迟缓或败育。对这些突变基因的克隆和功能研究对认识水稻叶绿体发育，培育高光效的水稻材料具有重要的研究意义。
[0004]水稻叶色变异作为形态标记具有易于鉴别、不受环境因素影响等特点，对产量等农艺性状影响不大的叶色变异在水稻生产中具有重要的应用价值。叶色标记作为提高杂交水稻种子纯度的有效途径之一，已被育种家在育种实践中应用。
[0005]目前只有少数的水稻叶色突变体基因被鉴定，仍有大量的叶色基因有待鉴定。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种新的水稻叶色基因，具有水稻叶色控制的功能，可利用该基因调控水稻叶绿体发育，提高光合作用效率，增加水稻产量。
[0007]本发明的第一方面，提供一种分离的水稻cpSRP54蛋白。
[0008]一种水稻叶色控制基因0scpSRP54编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性，所述蛋白质具有水稻叶色控制的功倉泛。
[0009]进一步地，所述的蛋白质氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸而生成的具有相同功能的氨基酸序列或衍生物。
[0010]优选地，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]在本发明的第二方面，提供一种分离的编码上述蛋白质的多核苷酸。
[0012]所述基因的核苷酸序列与SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性。
[0013]所述基因的核苷酸序列包括在SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列。
[0014]优选地,所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0015]本发明还提供了含有上述基因序列的质粒或植物表达载体或宿主细胞。
[0016]所述植物表达载体为PcpSRP54。
[0017]所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。宿主细胞含有上述载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。
[0018]在本发明的第五方面，提供一种使水稻叶色变淡的方法，该方法包括包括通过RNA1、Ant1-senseRNA、基因敲除或基因失活的方法降低具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的表达或活性。
[0019]本发明通过图位克隆技术从水稻淡绿叶突变体HM14中克隆控制水稻叶色的基因0scpSRP54,功能互补实验证明0scpSRP54是控制水稻叶色的基因。叶绿体透射电镜观察证明本发明克隆的基因具有调控叶绿体发育，进而控制叶色的功能。可利用该基因调控水稻叶绿体发育，提高光合作用效率，增加水稻产量。本发明的叶色控制基因还可作为基因转化植株后代的追踪标记和杂交制种过程中真杂种的指示标记，应用于良种繁育和杂交育种。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为水稻叶色突变体表型；其中，1:野生型IR64 ；2:突变体HM14。
[0021 ] 图2为0scpSRP54基因在水稻第11染色体上的精细定位。
[0022]图3为表达载体PcpSRP54图谱。
[0023]图4为功能互补实验TO代转基因水稻的表型示意图；其中，I:IR64 ；2:HM14 ；3:HM14-0scpSRP54。
[0024]图5为转基因植株的RT-PCR验证电泳图;其中，M =Marker ；1:IR64 ；2:HM14 ;3_7:
转基因植株。
[0025]图6为0scpSRP4基因的表达电泳图；其中，M =Marker ；1:叶；2:叶鞘；3:茎；4:根;5:幼穗。
【具体实施方式】
[0026]以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
[0027]实施例1:突变体的分离与遗传分析
通过对EMS诱变的水稻(IR64)突变体库的筛选，分离获得了一个水稻叶色突变体HM14，其表型能稳定遗传，在整个生育期内均表现为淡绿色(如图1所示)。利用突变体HM14与Moroberekan杂交获得F1，F1植株具有正常的叶色表型，F2代中的野生型和突变体表型的分离比符合孟德尔单隐性突变的分离比，说明突变体HM14的淡绿叶表型由单隐性基因控制。
[0028]实施例2:突变基因的精细定位
根据已公布的粳稻和籼稻的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各染色体上的SSR引物进行多态性检测及初步定位分析，将突变体HM14与Moroberekan杂交获得的F2群体中具有突变体表型的单株作为定位群体， 共鉴定1008株具有突变体表型的F2个体，其中的72株作为初定位群体。初定位结果表明突变基因位于第11染色体短臂RM1812和RM26092之间。
[0029]筛选获得RM1812和RM26092之间在亲本间有多态性的引物RM26076、RM26079和RM26085,并用这5对引物分析1008个F2群体中的突变个体，利用获得的信息构建物理图谱。最终将突变基因精细定位于第11染色体BAC克隆AC116949和AC138196上RM26076和RM26079标记之间40.7kb范围内(如图2所示)。
[0030]实施例3:基因预测和序列比对分析
根据精细定位的结果，对该区间的8个预测基因进行分析，发现一个编码叶绿体信号识别颗粒蛋白的cpSRP54基因。测序发现突变体HM14中该基因第一内含子中最后一个碱基发生了突变，可能影响了正常的剪接，因此将该基因定为候选基因并命名为0scpSRP54。 [0031]利用RT-PCR 技术，用引物对 SEQ ID N0.3 (TCGCTCATCGGCAATGGA)和 SEQ ID N0.4(TTCCACGGCATTCTTGGTTATT)扩增cDNA，比较0scpSRP54基因在野生型和突变体HM14中的片段大小，该实验证实由于碱基突变造成了突变体中第一内含子的保留，其扩增片段比正常剪接的野生型要大119bp (如图5所示)。
[0032]实施例4:0scpSRP54基因功能互补验证
构建包含0scpSRP54基因全长编码区(SEQ ID N0.1)及自身启动子的互补载体(图3)，转化到农杆菌EHA105，以农杆菌介导法转化突变体HM14。转基因植株表现为正常叶色表型，通过测序发现其在突变位点呈双峰，同时RT-PCR验证证实在转基因植株中含有正常剪接的片段(图5)，实验结果表明互补载体能够完全恢复HM14的突变表型(图4)。如图3所示的PcpSRP54，该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。
[0033]实施例5:0scpSRP54基因的表达
利用RT-PCR技术，比较了 0scpSRP54基因在各个组织中的表达情况，从图6可明显观察到叶片、叶鞘中0scpSRP54基因的表达明显高于根和穗中的表达，而在茎中未检测到0scpSRP54 的表达。
[0034]以上所述仅为本发明的若干个【具体实施方式】，应当指出，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种水稻叶色控制基因OscpSRP54编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列与SEQID N0.2所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性，所述蛋白质具有水稻叶色控制的功能。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质氨基酸序列为SEQIDN0.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸而生成的具有相同功能的氨基酸序列或衍生物。
3.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。
4.一种编码权利要求1、2或3所述蛋白质的基因。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列与SEQID N0.1所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列包括在SEQIDN0.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列。
7.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID N0.1所/Jn o
8.一种含有权利要求4-7任一权利要求所述基因序列的质粒或植物表达载体或宿主细胞。
9.根据权利要求8所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为PcpSRP54。
10.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
11.一种使水稻叶色变淡的方法，其特征在于，所述方法包括包括通过RNA1、Ant1-senseRNA、基因敲除或基因失活的方法降低具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的表达或活性。
【文档编号】A01H5/00GK103613649SQ201310527040
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】施勇烽, 吴建利, 王惠梅, 徐霞, 张晓波 申请人:中国水稻研究所