一种促进石斛兰组培苗壮苗及生根的方法
【专利摘要】本发明公开了一种促进石斛兰组培苗壮苗及生根的方法，包括如下步骤：1）将石斛兰组培苗转入壮苗及生根特定培养基中光照培养，壮苗并诱导生根；2）将已生根的组培苗经炼苗后即可进行移栽；3）将已生根的石斛兰组培苗再生植株移栽于树皮与蛭石混合的栽培基质里。本发明操作简单、易行，壮苗快，平均每株株高比对照组高3-4cm，茎直径比对照组粗2-3mm，鲜重比对照组重3倍，生根早，4-5天见根的形成，生根率高，30天生根率达100%，平均每株生根7-8根；移栽成活率高，可达到95%。本发明可有效缩短诱导生根时间，根系发育良好，植株健壮；移栽成活率高，同时对其他兰科组培苗的培养也具有重要参考价值。
【专利说明】一种促进石斛兰组培苗壮苗及生根的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物生物【技术领域】，具体涉及石斛兰的组织培养，尤其涉及一种促进石斛兰组培苗壮苗及生根的方法。
【背景技术】
[0002]石斛兰(D.0rchids)为兰科石斛属(Dendrobium)多年生草本植物,其主要用途是观赏和药用。石斛兰是国际著名的、最具观赏价值的四大名兰之一，具有种类繁多，花色艳丽，姿态优美，花多而密，花期长等诸多优良特性，可作盆栽和切花应用，适宜我国大部分地区集约化商品生产，应用前景广阔。石斛兰也是我国传统的名贵中药材，如著名的铁皮石斛、霍山石斛、金钗石斛等，在我国均有悠久的应用历史。现代药理研究表明，石斛兰有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集、促进血液循环、增强心脏活力等保健药用功效，具有极高的开发价值。
[0003]由于石斛兰经济价值极高，野生资源过度采挖极严重，1998年8月颁布的《中国植物红皮书》将几乎我国所有的石斛兰属植物都列入了保护名录。石斛兰对生态环境要求严格，种子发芽率极低，生长缓慢，自然更新困难，远不能满足需求。应用组织培养进行石斛兰快速繁殖，对于解决资源紧缺和实现产业化开发具有重要意义。
[0004]兰科植物的组织培养始于20世纪60年代，Morel采用兰花茎尖，在含有细胞分裂素的KC培养基上进行培养，茎尖分生组织膨大形成类原球茎，并分化出根和叶，首次获得兰花无病毒小植株。Wimber对Morel的方法进行改进，采用液体振荡培养的方法大大加快了原球茎的增殖速度，短期内可以获得大量再生植株，此后组织培养技术在兰花生产上得到了广泛的应用。
[0005]壮苗培养是提高移栽成活率的一项重要措施，生根效果也直接影响到生产效益。兰科植物的壮苗与生根很大程 度上与培养基大量元素及微量元素组分、植物生长调节剂的种类和浓度、添加的天然提取物有关，此阶段的关键在于严格筛选激素的种类和浓度。在基本培养基中添加一定浓度的NAA、IAA、IBA等激素有助于试管苗生根，但壮苗效果并不显著。唐桂香等的研究结果表明，NAA有助于试管苗的生根，但NAA浓度为0.5mg/L时，平均根数和根长值最大。蒙爱东等利用组织培养技术研究了多效唑对铁皮石斛试管苗壮苗培养的影响，结果表明，MS培养基中加入多效唑可明显促进试管苗的生长，有利于试管苗生根，提高移栽成活率；但是，多效唑处理后试管苗矮化、节间变短、叶变小、茎粗增大；叶片数与对照无显著差异，叶长和叶宽显著减小；根长减小，根数显著增加，根粗增加不明显。
[0006]刘骅等认为，最适宜铁皮石斛试管苗壮苗的培养基是B5或1/2MS基本培养基中添加2mg/L的NAA，香蕉提取物10%，蔗糖2%。生根壮苗适宜的培养基还有N6+10%香蕉汁，1/2MS+IBA0.lmg/L, 1/2MS+10% 香蕉汁 +0.5%AC 和改良 N6+0.2mg/LNAA+10% 香蕉汁等。
[0007]从文献报道可知，在生根培养基中通常加入香蕉汁、椰子汁等天然可促进生根壮苗。但吕秀立等报道认为添加10%椰子汁、香蕉汁等天然提取物，对春兰组培苗后期生长并没有促进作用，反而会引起黄化和进一步死亡。我们在大花蕙兰、千代兰、铁皮石斛、钩唇石斛等兰科植物的组培中添加了香蕉汁、马铃薯汁，也发现天然提取物反而促进了褐化的产生，根系生长不良，影响了植株的生长。
[0008]此外，由于天然提取物的提取方法、提取材料的成熟度和生理状态不同，提取物的纯度和有效浓度差异很大，对实验结果都会产生影响。天然提取物每次要现用现提取，无法长期保存，操作比较麻烦。在生根培养基中加入活性炭，有利于铁皮石斛试管苗的生长，能使根系长得更加粗壮。在培养基中添加活性炭有助于提高试管苗的成活率，但对苗的根数和根长影响较小。
[0009]因此选择更适合的既能促进壮苗又促进生根的植物生长调节剂犹为必要。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种促进石斛兰组培苗壮苗及生根的方法，使石斛兰组培苗在培养过程中生根快，生根率高，根系发达，根粗壮，再生植株生长健壮且移栽成活率高。
[0011]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下:
[0012]一种促进石斛兰组培苗壮苗及生根的方法，包括如下步骤:
[0013]I)将石斛兰组培苗转入壮苗生根培养基中光照培养，诱导生根；所述壮苗生根培养基的配方为MS基本培养基+恶霉灵HMI和/或糖醇螯合复合肥+琼脂粉+蔗糖。
[0014]2)在壮苗生根培养基中已生根的石斛兰组培苗经炼苗后移栽。
[0015]3)将已生根的石斛 兰组培苗再生植株移栽于树皮与蛭石1-3:1-3 (重量比)混合的栽培基质里，喷水保湿，温度25±2°C，相对湿度70-85%。
[0016]其中，上述步骤I)中，所述石斛兰组培苗是采用本领域的常规组织培养方法，利用植物离体培养的器官(如根、芽、种子、原球茎等)在无菌和适宜的人工培养基及光照温度等人工条件下，诱导培养所得的组织培养再生幼苗，此处的石斛兰组培苗是无根的。
[0017]优选地，上述步骤I)中，所述壮苗生根培养基的配方为MS基本培养基+1~IOmg/L恶霉灵HMI和/或糖醇螯合复合肥1000倍-8000倍+5_7g/L琼脂粉+20_30g/L蔗糖。
[0018]优选地，上述步骤I)中，所述壮苗生根培养基的配方为MS基本培养基+5mg/L恶霉灵HMI和/或糖醇螯合复合肥1000倍+5-7g/L琼脂粉+20_30g/L蔗糖。
[0019]进一步，上述步骤I)中，所述糖醇螯合复合肥优选霍尚澳优12元素液体复合肥。
[0020]上述步骤I)中，将石斛兰组培苗在无菌条件下切取幼苗，转入壮苗生根培养基中，光照培养条件为:培养温度为25°C ±2°C，光照时间为12-16小时/天，光照强度为1000-20001ux。
[0021]上述步骤2)中，幼苗在壮苗生根培养基中一般培养4-5周，此时幼苗生长健壮，茎粗壮，叶色浓绿，根系发达，在培养室中逐渐打开盖子，炼苗一周将苗移出瓶。
[0022]本发明在培养基中所使用的霍尚澳优12元素液体复合肥为澳洲埃尔夫公司1991年研发的12元素液体复合肥(broad spectrum foliar)。
[0023]本发明在培养基中所使用的恶霉灵，化学名称为3-羟基-5-甲基异恶唑，英文名称为HymemzoK缩写为HMI，下文不再赘述)，是一种内吸性杀菌剂和种子消毒剂。它除了具有良好的杀菌作用外，在适宜的浓度下，对多种作物的生长有调节作用。恶霉灵施于水稻秧田，可促进根系生长，增加分蘖，提高秧苗素质；用恶霉灵浸稻种能提高发芽率，增加植株干重，用70%恶霉灵可湿性粉剂处理土壤，增产稻谷12% ;此外，恶霉灵对马铃薯、洋葱、草莓、甜菜、豌豆均有促进生长和增产作用。此前未见其在石斛兰组织培养中应用的报道。
[0024]培养基中植物所需营养元素无论是大量元素氮磷钾还是微量元素硫镁锌硼等存在状态和浓度配比都对植株壮苗及生根影响非常大。糖醇物质可作为硼等其它营养元素载体，携带矿质养分在植物韧皮部中快速运输。
[0025]糖醇螯合化肥是中、微量元素等养分的良好络合剂，可与多种营养物质结合形成稳定的复合体，具有以下优点:
[0026]1.是目前唯一能携带矿质养分在韧皮部中进行快速运输的物质；
[0027]2.是植物韧皮部汁液中的天然提取物，无毒、对植物、人体无任何损伤；
[0028]3.分子量低，很容易被叶片吸收，进入到植株体内容易降解释放出养分，耗能低；
[0029]4.以液态为稳定的存在形式，尤其在碱性溶液中溶解度更高。由于韧皮部内是碱性环境，大部分金属类矿质养分在碱性环境下溶解性和移动性都较差，而糖醇复合体更能体现其能携带矿质养分在韧皮部移动的优势；
[0030]5.可以提高植物的抗逆性，一方面，糖醇是参与细胞内渗透调节的重要物质，植物在盐害、干旱、淹水等逆境胁迫下，糖醇可通过调节细胞渗透性使植物适应逆境生长；另一方面，糖醇可以提高对活性氧的抗性，避免由于紫外线日灼、干旱、病害、缺氧等原因造成的植株活性氧损伤。
[0031 ]目前还未见糖醇螯合复合肥在兰科植物组培上应用的报道。 [0032]本发明利用含有HMI和/或糖醇螯合复合肥的MS培养基对石斛兰组培苗进行生根诱导，极大地提高了生根率，移栽成活率也显著提高。
[0033]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0034]1.利用本发明的生根培养基诱导生根，其生根率可达100%，移栽成活率可达95%。
[0035]2.本发明能有效的缩短诱导生根时间，4-5天就见根的发生，且根系粗壮，根多，每个植株平均7-8个根。
[0036]3.本发明由于使用一定浓度的HMI和/或糖醇螯合复合肥，在促进生根的同时，提高了植株对养分的快速吸收，植株生长快且健壮，茎粗，叶厚，叶色浓绿，达到壮苗的目的。
[0037]4.本发明操作方法简单易行，成本低。在不加其他生长调节剂和其他不同天然附加物(如马铃薯、香蕉汁、苹果汁、椰汁等)以及活性炭的情况下，即可达到生根快、生根率高、植株生长健壮,成活率高的效果,节约了成本,简化了操作程序。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1为本发明实施例1植株的生长状况。
[0039]图2为本发明实施例1的生根植株。
[0040]图3为本发明实施例1的植株。
[0041]图4为本发明实施例2的生根植株。
[0042]图5为本发明实施例2植株的生长状况。
[0043]图6为本发明实施例3的植株(左)与实施例1的植株(右)对比图。
【具体实施方式】
[0044]以下结合附图与具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。[0045]实施例1
[0046]本实施例的铁皮石斛组培苗壮苗生根培养方法，具体步骤如下:
[0047]I)取来自于茎段外植体的2cm高的铁皮石斛组培苗(无根)，无菌条件下切取幼苗，转入装有壮苗生根培养基的培养瓶中培养，将培养瓶置于光照条件下培养，培养温度为250C ±2°C，光照时间为16小时/每天，光照强度为lOOOlux ;生根壮苗培养基的配方为MS基本培养基+5mg/LHMI+5g/L琼脂粉+30g/L蔗糖。
[0048]培养4-5天就有根的发生，培养一个月后统计生根率达100% (见图1)，平均每株生根6-8根，根长植株高度平均达7.1-7.8cm (见图2)，叶色浓绿，叶大且厚，茎直径平均
0.47-0.5cm (见图3)，平均每株鲜重1.4-1.6g。
[0049]2)幼苗在壮苗生根培养基中培养4-5周，此时幼苗健壮，根系发达，逐步打开瓶盖炼苗一周，将幼苗移出瓶，用清水冲洗根部的培养基，移栽到树皮与蛭石1:1混合的栽培基质里，喷水保湿。温度25°c ±2°C，相对湿度70%。栽培的植株成活率高，达95%。植株生长健壮。
[0050]实施例2
[0051]本实施例的铁皮石斛组培苗壮苗生根培养方法，具体步骤如下:
[0052]I)取来自于茎段外植体的2cm高的铁皮石斛组培苗(无根)，无菌条件下切取幼苗，转入装有壮苗生根培养基的培养瓶中培养，将培养瓶置于光照条件下培养，培养温度为250C ±2°C，光照时间为16小时/天，光照强度为1000Iux ;生根壮苗培养基的配方为MS基本培养基+霍尚澳优12元素液体复合肥1000倍+5g/L琼脂粉+30g/L蔗糖；
[0053]培养15天有根的发生，培养45天后统计生根率达100%，平均每株生根7-8根，根粗壮，整齐(见图4)，植株高度平均达8.1-8.8cm，叶色浓绿(见图5)，叶大且厚，茎直径平均
0.5-0.6cm，平均每株鲜重 1.7-1.8g。
[0054]2)幼苗在壮苗生根培养基中培养4-5周，此时幼苗健壮，根系发达，逐步打开瓶盖炼苗一周，将幼苗移出瓶，用清水冲洗根部的培养基，移栽到树皮与蛭石1:1混合的栽培基质里，喷水保湿。温度25°c ±2°C，相对湿度70%。栽培的植株成活率高，达95%。植株生长健壮。
[0055]实施例3
[0056]本实施例的铁皮石斛组培苗壮苗生根培养方法，具体步骤如下:
[0057]1)取来自于茎段外植体的2cm高的铁皮石斛组培苗(无根)，无菌条件下切取幼苗，转入装有壮苗生根培养基的培养瓶中培养，将培养瓶置于光照条件下培养，培养温度为250C ±2°C，光照时间为16小时/天，光照强度为1000Iux ;生根壮苗培养基的配方为MS基本培养基+5mg/LHMI+霍尚澳优12元素液体复合肥1000倍+5g/L琼脂粉+30g/L蔗糖；
[0058]培养5天有根的发生，培养25天后统计生根率达100%，平均每株生根7-8根，根粗壮，整齐，植株生长势强于只加HMI的处理(见图6)，叶色浓绿，叶大且厚。 [0059]2)幼苗在壮苗生根培养基中培养4-5周，此时幼苗健壮，根系发达，逐步打开瓶盖炼苗一周，将幼苗移出瓶，用清水冲洗根部的培养基，移栽到树皮与蛭石1:1混合的栽培基质里，喷水保湿。温度25°C ±2°C，相对湿度70%。栽培的植株成活率高，达95%。植株生长健壮。
[0060]实施例4对照组[0061]I)取来自于茎段外植体的，2cm高的铁皮石斛组培苗(无根)，无菌条件下切取幼苗，转入装有不加任何激素MS培养基的培养瓶中培养，将培养瓶置于光照条件下培养，培养温度为25°C ±2°C，光照时间为16小时/天，光照强度为lOOOlux ;培养基的配方为MS培养基+5g/L琼脂粉+30g/L蔗糖；
[0062]培养20天有根的发生，培养一个月后统计生根率达20%，平均每株生根3根，植株高度平均达3.4cm，植株细小，茎直径平均0.2cm，平均每株鲜重0.5g。
[0063]2)幼苗在培养基中培养4-5周，逐步打开瓶盖炼苗一周，将幼苗移出瓶，用清水冲洗根部的培养基，移栽到树皮与蛭石1:1混合的栽培基质里，喷水保湿。温度25°C ±2°C，相对湿度70%。栽培的植株成活率仅为40%。植株长势慢。
[0064]最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。`
【权利要求】
1.一种促进石斛兰组培苗壮苗及生根的方法，包括如下步骤: 1)将石斛兰组培苗转入壮苗生根培养基中光照培养，诱导生根；所述壮苗生根培养基的配方为MS基本培养基+恶霉灵HMI和/或糖醇螯合复合肥+琼脂粉+蔗糖； 2)在壮苗生根培养基中已生根的石斛兰组培苗经炼苗后移栽； 3)将已生根的石斛兰组培苗再生植株移栽于树皮与蛭石混合的栽培基质里，喷水保湿，温度25 ± 2 °C，相对湿度70-85%。
2.如权利要求1所述的促进石斛兰组培苗壮苗及生根的方法，其特征在于，所述壮苗生根培养基的配方为MS基本培养基+1~10mg/L恶霉灵HMI和/或糖醇螯合复合肥1000倍-8000 倍 +5-7g/L 琼脂粉 +20-30g/L 蔗糖。
3.如权利要求2所述的促进石斛兰组培苗壮苗及生根的方法，其特征在于，所述壮苗生根培养基的配方为MS基本培养基+5mg/L恶霉灵HMI和/或糖醇螯合复合肥1000倍+5-7g/L 琼脂粉 +20-30g/L 蔗糖。
4.如权利要求2或3所述的促进石斛兰组培苗壮苗及生根的方法，其特征在于，所述的糖醇螯合复合肥为霍尚澳优12元素液体复合肥。
5.如权利要求1所述的促进石斛兰组培苗壮苗及生根的方法，其特征在于，步骤I)中光照培养条件为:培养温度为25°C ±2°C，光照时间为12-16小时/天，光照强度为1000-20001ux。
6.如权利要求1所述的促进石斛兰组培苗壮苗及生根的方法，其特征在于，步骤3)中所述树皮与蛭石混合的栽培基质·里两者重量比为1-3:1_3。
【文档编号】A01H4/00GK103843662SQ201410085598
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月10日 优先权日:2014年3月10日
【发明者】周音, 张建军, 陈敏敏, 谢纪红 申请人:上海市农业科学院