甘露糖在提高植物耐镉及镉积累以及在修复镉污染土壤中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种甘露糖在提高植物耐镉及镉积累中的应用，也即是将所述甘露糖加入到所述植物的生长环境中。在修复镉污染土壤应用中，可以将将1.5mM甘露糖以浇灌的方式加入镉污染的土壤中提高植株对镉毒害的耐受性，增加植株体内的镉含量。甘露糖与植株的镉胁迫缓解和镉含量增加有直接的关系，通过在植物的生长环境中加入甘露糖可以提高植物耐镉及镉积累。从而可以将甘露糖应用于修复镉污染土壤。本发明方法简便，成本低，可控性好，非常适于大面积推广应用于修复镉污染土壤中。
【专利说明】甘露糖在提高植物耐镉及镉积累以及在修复镉污染土壤中的应用
【技术领域】
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[0001]本发明涉及植物生理生化，特别涉及甘露糖在提高植物耐镉及镉积累以及在修复镉污染土壤中的应用。
【背景技术】
[0002]镉(Cd)是一种具有极强生物毒性的重金属元素，当Cd的浓度在一定范围内，它对植物的毒害性比其他重金属要大得多。近年来，由于社会的不断发展，工业废水废气废渣的大规模排放、农田灌溉水源被有毒有害成分污染、剧毒农药和有害除草剂及传统化肥的大量使用，使得土壤中Cd等重金属的浓度上升加剧。随着人类社会发展的进一步深入，Cd的生物地球化学循环不断加速。据测算，全世界每年由于人为因素向环境中释放的Cd有30000 t左右，排放到环境中的Cd约有82%?94%进入土壤。土壤中过量的Cd又容易被植物吸收和富集，影响植物的正常生长和发育，不仅严重削弱了农作物的产量和品质，而且积累在植物体中的Cd，不仅不易排出植物体外，还可通过食物链的层层富集，最终进入人体，威胁着人类的健康，是人类生存的潜在隐患。1972年，联合国粮农组织(FAO)与世界卫生组织(WTO)联合专家委员会在关于食品污染毒性报告中指出，Cd的食品污染物毒害性位居第三，1984年，联合国环境规划署提出的具有全球意义的12种危害物质中，Cd位列第一，并于1993年被正式确定为致癌物质。
[0003]拟南芥具有以下特点:植株个体较小，不占空间、生长周期短，从播种到收获不超过8周，便于观察、结子多，易于扩培、生活力强，生长条件简单，可用普通的土培或皿培，无需大量人工管理。拟南芥是一种研究植物的模式生物，它的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研究。因此，拟南芥抗重金属毒害的研究可以推广到农作物，对提高粮食的产量和增加食品安全性具有重要的理论与经济意义。
[0004]植物螯合肽(PCs)广泛存在于植物体中，与植物抗重金属胁迫关系密切。植物螯合肽及其复合物是一类富含半胱氨酸的低分子量化合物。现有研究证明，PCs由谷胱甘肽(GSH)为底物的酶促反应合成，其合成受相关基因的调控，从模式植物拟南芥的突变体中已分离到与PCs合成有关的几个基因。植物螯合肽首先与重金属离子结合形成低分子量(LMW)复合物，以此形态经由细胞质进入液泡后，再与一个分子的植物螯合肽结合，形成对植物组织毒性较小的高分子量(HMW)复合物，从而达到缓解重金属对植物的危害作用。
【发明内容】
[0005]为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种全新的提高耐镉及镉积累的方法，并可将该方法应用于修复镉污染土壤中。
[0006]本发明的目的之一是保护甘露糖在提高植物耐镉及镉积累中的应用。
[0007]所述应用是指将所述甘露糖加入到所述植物的生长环境中。
[0008]本发明的另一目的是保护一种修复镉污染土壤的方法，该方法即是将1.5mM甘露糖以浇灌的方式加入镉污染的土壤中提高植株对镉毒害的耐受性，增加植株体内的镉含量。
[0009]本发明相比现有技术，具有如下技术效果:
[0010]甘露糖与植株的镉胁迫缓解和镉含量增加有直接的关系，通过在植物的生长环境中加入甘露糖可以提高植物耐镉及镉积累。从而可以将甘露糖应用于修复镉污染土壤。本发明方法简便，成本低，可控性好，非常适于大面积推广应用于修复镉污染土壤中。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为野生型和xcdl-2突变体在镉胁迫下加入甘露糖后的表型比较(A.1/2MS ；B.1.5mM 甘露糖 +1/2MS ；C.50 μ M CdCl2+l/2MS ；D.50 μ M Cd+1.5mM 甘露糖 +1/2MS)。
[0012]图2为野生型和xcdl-2突变体在镉胁迫下加入甘露糖后的根长鲜重比较(A.野生型和突变体xcdl-2的根长比较；B.野生型和突变体xcdl-2的鲜重比较)。
[0013]图3为甘露糖荧光光谱
[0014]图4为野生型和xcdl-2突变体在镉胁迫下加入外源甘露糖后根部的镉含量。
[0015]图5为野生型在镉胁迫下加入外源甘露糖后植株内植物螯合肽的含量。
【具体实施方式】
[0016]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。下述方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0017]本发明方法适用于自然界中的各种植物及作物，下面仅以拟南芥植物为例对本发明技术方案做进一步解释说明。本发明所使用的拟南芥，包括拟南芥野生型WT和xcdl-2突变体。xcdl-2突变体是XCDl基因功能缺失突变体，拟南芥XCDl基因编码一个(1，4) - β -甘露聚糖水解酶。可以将甘露聚糖水解为小分子甘露糖。本发明甘露糖为现有市售产品。
[0018]实施例1、在有镉的培养基中加入甘露糖后植株的表型比较
[0019]将野生型和xcdl-2分别直接点种在1/2MS、1.5mM甘露糖+1/2MS、50 μ MCdCl2+l/2MS和50 μ M CdCl2+l.5mM甘露糖+1/2MS的四种培养基中，将1/2MS和加入1.5mM甘露糖的1/2MS培养基作为对照，图1示出了四种培养基的表型，图1A-B可以看出，在1/2MS和1.5mM甘露糖培养基中突变体xcdl-2和WT的生长发育均没有显著差异，说明外加甘露糖没有影响植株的正常生长，图1C可以看出在50μΜ CdCl2条件下，与对照组相比植株的根长短，侧根较多，叶片较小，表明野生型和xcdl-2突变体都受到了镉胁迫，而且xcdl-2突变体的生长明显较WT弱。同时，图1D可以看出，在镉胁迫条件下加入外源甘露糖，野生型和突变体的生长都比镉胁迫下要好，根长明显增长，突变体的主根和野生型相比差不多，说明在生长环境中加入甘露糖后，镉对野生型和xcdl-2突变体的胁迫得到了缓解。
[0020]实施例2、在有镉的培养基中加入甘露糖后植株的量化数据比较
[0021]在培养基中竖直培养的拟南芥生长3周后，从培养皿的背面，用直尺量取，尽量选择中间长度的，测量不同10株的根长，单位Cm。用精密电子天平来测量拟南芥组织的鲜重，测量5株，单位为g/5plants，取不同植株测量三次。
[0022]对比分析了镉胁迫下外源甘露糖加入后突变体和野生型的根长与鲜重，图2示出了鲜重比较结果，图2A-B示出1/2MS培养基中xcdl-2和WT植株的根长与鲜重均没有明显的差异，在1.5mM甘露糖+1/2MS培养基中xcdl-2和WT植株之间的根长和鲜重也没有显著差异，但是鲜重略低于1/2MS培养基中的植株。在50 μ M的Cd胁迫条件下xcdl-2植株的根长和鲜重都低于WT植株，而且突变体xcdl-2和WT植株的根长鲜重明显比对照组1/2MS和1.5mM甘露糖+1/2MS培养基中的根长鲜重较低，这种显著差异与敏感表型吻合。而在镉胁迫下加入外源甘露糖后的数据比较表明，无论是xcdl-2还是WT根长鲜重都显著上升，xcdl-2比WT稍低一些。表明是外源甘露糖缓解了镉对植株的胁迫。
[0023]实施例3、镉与甘露糖直接结合的实验证据
[0024]在含镉的培养中加入外源甘露糖能够增加植物对镉的耐受，为了阐明外源甘露糖缓解植株镉胁迫的机理，我们首先设计实验验证镉与甘露糖能否直接结合。通过核磁共振113Cd谱表明，在50 μ M CdCl2D2O溶液中加入1.5mM甘露糖后核磁共振113Cd谱峰的形态发生了改变，表明甘露糖和镉可能存在直接的相互作用，为了进一步验证甘露糖与镉的相互作用，我们补充了甘露糖核磁共振氢谱及荧光光谱(图3)，结果表明甘露糖与镉可能存在极弱的相互作用，甘露糖与镉不能形成稳定和螯合物。综上，可以排除甘露糖与镉在培养基中直接结合，说明镉是被根部吸收到植物体内发挥作用。
[0025]实施例4、在有镉的培养基中加入甘露糖后植株体内镉含量比较
[0026]将MS培养基垂直生长3周的拟南芥野生型和突变体幼苗，整株移到含100 μ MCdCl2和100 μ M CdCl2+l.5mM甘露糖的液体MS培养基中，短期浸泡约48h，用预冷的蒸馏水清洗多次，再用1.5mM CaCl2溶液清洗两遍，最后用0.25mM CaCl2 (含0.25mM柠檬酸)溶液清洗去除根部的非原生质体Cd。仔细分开根系和地上部，并分别称取鲜重，用硝化法测量植株根部和地上部分镉含量。
[0027]对植株体内的镉含量进行了分析，图3可以看出，与在镉胁迫条件下相比，在镉加甘露糖条件下，突变体xcdl-2和野生型植株的镉含量有明显的提高，但无论是在镉胁迫条件下还是在镉加甘露糖条件下，突变体xcdl-2比野生型植株的镉含量略低。敲除突变体xcdl-2中XCDl基因缺失，使其植株中甘露糖减少，因此在镉胁迫下和加入甘露糖后都比野生型生长差一些。表明甘露糖与植株的镉胁迫缓解和镉含量增加有直接的关系。
[0028]实施例5、在有镉的培养基中加入甘露糖后植株体内植物螯合肽含量比较
[0029]将野生型直接点种在1/2MS、1.5mM 甘露糖+l/2MS、50yM CdCl2+l/2MS 和 50 μ MCdCl2+l.5mM甘露糖+1/2MS的四种培养基中，垂直生长3周，采用谷胱甘肽还原酶循环法分别测定四种培养基中非巯基蛋白和总谷胱甘肽的含量，植物螯合肽的含量等于非巯基蛋白的含量减去总谷胱甘肽的含量，在1/2MS、1.5mM甘露糖+1/2MS两种培养中生长幼苗中PCs没有被检测到，由图4可知，在有镉的培养基中加入甘露糖后，PCs的含量显著上升，PCs螯合重金属镉形成复合体，并隔离到液泡内，从而增加植物对镉的耐受。
【权利要求】
1.甘露糖在提高植物耐镉及镉积累中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，将所述甘露糖加入到所述植物的生长环境中。
3.一种修复镉污染土壤的方法，其特征是，将1.5mM甘露糖以浇灌的方式加入镉污染的土壤中提高植株对镉毒害的耐受性，增加植株体内的镉含量。
【文档编号】A01B79/02GK104249075SQ201410348568
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】曹树青, 陈健, 阳立波, 柏晓娅, 顾菊, 管灵霞 申请人:合肥工业大学