烟草ε-番茄红素环化酶基因及其应用的制作方法

烟草ε-番茄红素环化酶基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草ε-番茄红素环化酶基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。本发明通过同源克隆的方式，从栽培烟草红花大金元体内克隆获得Ntε-LCY基因序列，并且进行了表达模式及亚细胞定位分析。利用烟草脆裂病毒（Tobaccorattlevirus，TRV）诱导基因沉默注射本氏烟草，结果表明ε-LCY的部分沉默可以提高烟叶中类胡萝卜素含量，并且增强烟株抵御光抑制的能力。该研究结果能够为利用基因工程技术培育优良品种提供理论依据和基因资源。
【专利说明】烟草ε-番茄红素环化酶基因及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，具体涉及在烟草中，一种类胡萝卜素合成关键基 因 Nt ε -LCY及其应用。

【背景技术】
[0002] 类胡萝卜素是自然界广泛存在的一类重要萜类物质，一切光合组织中都能合成此 类物质。高等植物类胡萝卜素合成通路产生的中间物质如α-胡萝卜素（a-carotene)、 β -胡萝卜素（β-carotene)、黄体素（lutein)、新黄质（neoxanthin)、紫黄质 (violaxanthin)、玉米黄质（zeaxanthin)等参与了高等植物体内诸多重要的生理过程。类 胡萝卜素在光合作用中起重要作用，是光合作用中光传导途径和光反应中心的重要组成部 分，作为叶绿体光合天线的辅助色素，有助于叶绿体吸收光能；另一方面，类胡萝卜素在高 温、强光下能通过叶黄素循环，以非光化学辐射的方式耗散光系统II (PSII)的过剩能量， 保护叶绿素免受氧化损伤的破坏。此外，类胡萝卜素也是合成植物激素脱落酸（ΑΒΑ)的前 体物，ΑΒΑ广泛地参与植物生长周期发育的各个环节和抗逆过程。番茄红素环化是该通路 的一个重要分支点，番爺红素在番爺红素 β-环化酶（lycopene β-cyclase, β-LCY)或者 番爺红素 ε-环化酶（lycopenes-cyclase, ε-LCY)的作用下形成为β-胡萝卜素或者 胡萝卜素。ε-LCY和β-LCY两个酶的活性在一定程度上决定了两个分支产物黄体素、 胡萝卜素、紫黄质、玉米黄质等胡萝卜素类物质的比例。植物中众多的研究实例都表明 ε -LCY是调控黄体素和β-胡萝卜素含量比例的关键酶。ε -LCY在玉米体内的自然变异 能够解释玉米品种间58%的黄体素和β-胡萝卜素含量差异。拟南芥ε-LCY的表达抑制 株系也出现了黄体素和β-胡萝卜素含量比例的显著变化，土豆ε-LCY的表达抑制同样造 成了 β_胡萝卜素含量的显著上升。油菜种子中ε-LCY的表达抑制导致β-胡萝卜素、紫 黄质和玉米黄质等物质含量的上升，但是黄体素的含量也大幅提高，这表明不同植物体内 可能存在不同的遗传机制或调控机制。
[0003] 类胡萝卜素是一类重要的香味前体物，其通过降解、转化可形成一系列的致香物 质。烟叶中类胡萝卜素的含量不但决定了烤后烟叶的外观品质，同时也能够影响烟叶的吸 食品质，其降解产物占烟叶总挥发性香气成分的8%-12%。类胡萝卜素的降解和热裂解产 物可生成近百种香气化合物，如巨豆三烯酮、β_大马酮等，这些香味物质阈值相对较低，刺 激性较小，对烟叶香气贡献率大，是形成烤烟细腻、高雅和清新香气的主要成分。Weeks研究 发现，在烟叶品质提高的同时，类胡萝卜素降解物含量明显增加。对β_胡萝卜素降解产物 进行了加香实验，结果表明添加 β_胡萝卜素的降解产物能够丰满烟气，增浓烟香。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的探索一种利用基因工程方法增加类胡萝卜素的合成效率，尤其是 β-胡萝卜素合成的效率。
[0005] 本发明的技术方案是：烟草ε -番茄红素环化酶基因，其碱基序列如SEQ ID Ν0 :1 所示。烟草ε-番茄红素环化酶基因，其编码序列如SEQ ID NO :2所示。
[0006] 所述的烟草ε -番茄红素环化酶基因的应用，所述烟草番茄红素 ε环化酶基因提 高烟草类胡萝卜素含量。
[0007] 一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，通过瞬时表达技术干扰、沉默烟草番茄红 素 ε环化酶基因，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。
[0008] 所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，以所述烟草番茄红素 ε环化酶基因的 特异性核苷酸片段作为引导序列，将特异性核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体 中，构建烟草番茄红素 ε环化酶基因的病毒诱导基因沉默载体和RNAi载体。
[0009] 本发明利用一种快速、简单、可靠的方法，病毒诱导基因沉默技术，即可下调类胡 萝卜素合成关键基因 ε -番茄红素环化酶，从而显著提高类胡萝卜素含量且增强植株抵御 光抑制的能力。
[0010] 本发明通过同源克隆的方式，从栽培烟草红花大金元体内克隆获得Nt ε-LCY基 因序列，并且进行了表达模式及亚细胞定位分析。利用烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV)诱导基因沉默注射本氏烟草，结果表明ε-LCY的部分沉默可以提高烟叶中类 胡萝卜素含量，并且增强烟株抵御光抑制的能力。该研究结果能够为利用基因工程技术培 育优良品种提供理论依据和基因资源。
[0011] 首先，从普通烟草cDNA中扩增出ε-番茄红素环化酶基因，命名为Nt ε-LCY。并 且从基因组DNA中扩增出Nt ε -LCY的全长序列，绘制该基因结构图；研究了 Nt ε -LCY基因 在烟草不同时期不同器官中的转录水平表达模式，发现该基因主要在幼叶中表达。采用激 光共聚焦发现该蛋白定位在叶绿体中；利用烟草脆裂病毒介导的病毒诱导基因沉默技术研 究了四倍体烟草类胡萝卜素合成通路基因表达和类胡萝卜素含量变化，及对叶片光合系统 ε -LCY基因部分沉默情况下发生光抑制程度的变化。
[0012] 在烟草中，探索一个类胡萝卜素合成关键基因 Nt ε -LCY，并建立起一种快速提高 类胡萝卜素含量，提高光抑制效应的可靠的方法。该方法无需采用费时费力的转基因技术， 在一个月内即可达到目的。本发明揭示了烟草中ε-LCY基因在类胡萝卜素合成中的重要 功能，对类胡萝卜素组成的调控起着至关重要的作用，为植物分子改良提供了良好的理论 指导。

【专利附图】

【附图说明】
[0013] 图1 :Nt ε -LCY全长基因序列和拟南芥At ε -LCY、西红柿S1 ε -LCY、绒毛烟草 Ntom ε -LCY和林烟草sly ε -LCY基因结构比对；
[0014] 图2 :Nt ε -LCY-GFP融合蛋白的亚细胞定位。将融合表达载体Nt ε -LCY-GFP基因 枪法轰击ΒΥ-2悬浮细胞进行Confocal观察，Α是Nt ε -LCY-GFP荧光，Β是叶绿素荧光，C 是明场下细胞图像，D是A、B、C图像的叠加；
[0015] 图3 :3A为四倍体栽培烟草中不同时期、（stagel-Stage4分别为还苗期、盛花期、 打顶期和成熟期）的各类器官[根-R、茎-S、叶-L (5叶位-5L，10叶位-10L，15叶位-15L)、 花-F]中Nt ε -LCY-GFP的转录表达模式，3B是在低温弱光胁迫下Nt ε -LCY表达模式。用 定量PCR技术检测；
[0016] 图4:本氏烟草中定量PCR检测病毒介导的ε-LCY基因沉默效果。图中C0N代表 未接种病毒的烟草，TRV代表接种了 TRV空病毒载体的烟草，TRV- ε -LCY代表接种了带有 ε-LCY基因片段病毒的烟草；
[0017] 图5:本氏烟草中HPLC检测病毒介导的ε-LCY基因沉默后烟草植株类萝卜素 (β_胡萝卜素、紫黄质、新黄质和黄体素）含量及叶绿素 Α和Β的含量。图中C0N代表未接 种病毒的烟草，TRV代表接种了 TRV空病毒载体的烟草，TRV- ε -LCY代表接种了带有ε -LCY 基因片段病毒的烟草；
[0018] 图6 :本氏烟草中定量PCR检测病毒介导的ε -LCY基因沉默后类胡萝卜素合成通 路基因转录表达图，图中C0N代表未接种病毒的烟草，TRV代表接种了 TRV空病毒载体的烟 草，TRV- ε -LCY代表接种了带有ε -LCY基因片段病毒的烟草；
[0019] 图7 :7Α为四倍体栽培烟草中病毒介导的ε -LCY基因沉默后叶片在低温弱光胁迫 条件下Fv/Fm的变化，Fv/Fm是指植物叶片光合系统II的最大光化学效率；7Β为四倍体栽 培烟草中病毒介导的ε-LCY基因沉默后叶片在低温弱光胁迫条件下NPQ的变化（非光化 学耗散）。【具体实施方式】
[0020] 烟草ε -番茄红素环化酶基因，其碱基序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0021] 烟草ε -番茄红素环化酶基因，其编码序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0022] 所述的烟草ε -番茄红素环化酶基因的应用，所述烟草番茄红素 ε环化酶基因提 高烟草类胡萝卜素含量。
[0023] -种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，通过瞬时表达技术干扰、沉默烟草番茄红 素 ε环化酶基因，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。
[0024] 所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，以所述烟草番茄红素 ε环化酶基因的 特异性核苷酸片段作为引导序列，将特异性核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体 中，构建烟草番茄红素 ε环化酶基因的病毒诱导基因沉默载体和RNAi载体。
[0025] l、Nt ε -LCY基因的同源克隆以及基因结构分析
[0026] 通过NCBI网站搜索到ε -LCY基因所有的EST序列，通过比对拼接，在ATG和TGA 处设计保守引物进行克隆，从栽培烟草cDNA中依次进行PCR扩增，回收目的片段，Τ-Α连 接，转化细菌感受态细胞，37°C培养，菌落PCR鉴定得到阳性克隆，阳性质粒提取，最后进行 质粒酶切鉴定和测序，得到Nt ε -LCY编码区（⑶S)全长序列1575bp。将此基因氨基酸序列 与西红柿、马铃薯及拟南芥氨基酸序列进行比对，其相似性分别高达89 %、89 %和72 %，推 测烟草Nt ε -LCY可能与其他植物具体相似的生物学功能。利用保守引物以栽培烟DNA为 模板进行扩增，得到Nt ε -LCY基因全长序列4356bp，将栽培烟草基因结构图与西红柿、拟 南芥、林烟草和绒毛烟草的基因结构图进行比对，结果如图1所示：该基因结构在不同物种 间相当保守，包含了 11个外显子和10个内含子。
[0027] 具体步骤如下所述：
[0028] 所用引物为 5' -ATGGATTGTATTGGAGCTCGAAAT-3' 和 5' -CTAAAATGTAAGATAAGTTC TTATCA-3'。作为模板的cDNA和DNA都来自栽培烟草红花大金元旺长期幼叶片（RNA和DNA 提取按照QIAGEN公司RNA或DNA提取试剂盒说明书进行）。按照Reverse transcription system试剂盒说明书，以Oligo (dT) 18 (TaKaRa公司）为引物合成cDNA第一链。首先 以cDNA为模板PCR扩增反应体系及条件如下：反应体系为50 μ L，模板2 μ L，引物各 2. 5 μ L (10 μ moL/L)，dNTPs (10 μ moL/L) 4 μ L，buffer (10 X，Mg2+plus) 5 μ L，Taq 酶（北京全 式金生物技术有限公司）0. 5 μ L，灭菌水33. 5 μ L。其反应参数：94°C预变性3min，94°C变性 3〇8,521：退火3〇8,721：延伸9〇8,35个循环；最后721：延伸1〇1^11。？0?产物进行琼脂糖凝 胶电泳，用凝胶提取试剂盒（Gel Extraction KIT,购自QIAGEN公司）从琼脂糖凝胶上纯化 目标ε -LCY Q)S片段（方法参照试剂盒说明书），用Eppendorf公司BioPhotometer测定 浓度后用于连接或存_20°C备用。纯化的ε-LCY CDS片段与pMD19-T载体（TaKaRa公司， 氨节霉素抗性）连接（Solution I ligase，TaKaRa公司，按照试剂盒说明书操作），热激转 化（42°C 90s)入大肠杆菌DH5 a (TaKaRa公司）。从得到的克隆转化子中用菌落PCR(引物 为上述扩增引物）鉴定阳性克隆，提取阳性克隆质粒Nt ε -LCY-T (小提质粒试剂盒，QIAGEN 公司，方法参照试剂盒说明书进行）。阳性质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测 序。
[0029] 烟草Nt ε -LCY基因全长扩增以栽培烟草DNA组为模板，其反应参数：94°C预变性 3min，94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸5min，35个循环；最后72°C延伸lOmin。反应 体系及纯化、连接、转化条件与上述条件一致。经菌落PCR验证阳性后，提取阳性克隆质粒 送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
[0030] 2、Nt ε -LCY的蛋白定位于叶绿体
[0031] 为了得到最确切的Nt ε -LCY蛋白亚细胞定位结果，构建Nt ε -LCY-GFP融合蛋白 载体。采用基因枪轰击转化烟草悬浮细胞（ΒΥ-2)，用激光共聚焦显微镜观察其定位，结果如 附图2所示，Α为融合蛋白绿色荧光，Β为叶绿素自身的红色荧光，C为明场下的细胞图像，D 为三者的重叠图像，由D图可见，融合蛋白的绿色荧光恰与叶绿素的红色荧光重叠在一起， 表明Nt ε -LCY蛋白定位在叶绿体中，这与其可能发挥的光合生理作用是一致的。
[0032] 具体方法如下所述：
[0033] 以 5，-ΤΑ GTCGAC ATGGATTGTATTGGAGCTCGAAAT-3，（含 Sail 酶切位点）和 5' -GCGGATCCMATGTAAGATMGTTCTTATCA-3'(含BamH I 酶切位点）为引物，以测序正确 的Nt ε -LCY-T为模板，进行扩增，产物回收纯化，使用Sail和BamH I进行酶切再纯化，连接 同样由Sail和BamH I酶切之后回收纯化的pJIT163-GFP载体，热激转化大肠杆菌DH5 α， 经菌落PCR定阳性克隆，提取质粒并测序正确后，得到pJIT163-Nt ε -LCY-GFP融合表达载 体。具体的分子克隆技术如1中所不。
[0034] 米用基因枪〇i〇-Rad FOSIOOO/He system)轰击烟草ΒΥ2悬浮细胞系技术进行。 BY-2悬浮细胞接种在MS培养基中，26°C，130rpm震荡培养7天。0. 5mg DNA与金粉混合， 轰击BY2悬浮细胞系；轰击后要26°C暗培养12小时，之后用激光共聚焦显微镜观察荧光 (BX50-FLA, Olympus) 〇
[0035] 3、Nt ε -LCY表达模式分析
[0036] 采集栽培烟草的各个时期（还苗期、盛花期、打顶期和成熟期）的各类器官[根、 茎、叶（5叶位，10叶位，15叶位）、花]样品，并提取它们的总RNA，反转录成为cDNA(方法 参看1)。定量PCR ((BI0-RAD，USA))分析Nt ε -LCY时空表达模式和低温弱光胁迫下的表达 模式。如附图3Α中所示，Nt ε -LCY在盛花期表达量较高，且多表达在幼叶中（表达水平： 15叶位> 10叶位> 5叶位>花彡茎>根）。在低温弱光胁迫下，Nt ε -LCY表达量呈上升 趋势（见图3Β)。转录水平表达模式的研究结果表明，该基因与植物的生理状态密切相关， 在烟株光合生理较为强盛的幼嫩组织表达量较高，且能够被光抑制条件诱导，参与烟株抵 御光抑制的过程，其生物学功能必然与光合生理过程存在密切的关系。
[0037] 表达模式分析所用烟草器官样品均在云南大田采样，所用的引物见表1 中ε -LCY-Q-F/R，采用26s RNA作为内参。PCR扩增反应条件：95 °C预变性3min ; 95°〇208,601：208,40个循环。反应体系：1以1^。0嫩，1(^1^3￥81?6代611，上下游引物各 1 μ L (10 μ mol/L)，补 ddH20 至 20 μ L。
[0038] 4、烟草中下调ε -LCY表达提高类胡萝卜素含量并增强植物抵御光抑制能力
[0039] 为研究如何增加烟草中类胡萝卜素含量，采用了一种快速可靠的方法，利用烟草 脆裂病毒介导的烟草内源基因沉默，在本氏烟中下调了 ε-LCY基因的表达，在ε-LCY基因 部分沉默的情况下，烟草中类胡萝卜素含量发生显著变化，同时在正常生长条件和胁迫条 件下的光合系统效率也随之变化。
[0040] 烟草脆裂病毒载体感染能力强，病毒症状轻，空载体侵染与对照植株生长发育无 明显差异。TRV- ε -LCY混合阳性菌株接种本氏烟草后，烟株新叶中ε -LCY基因表达被抑 制，只有对照植株的10% (甚至更低），说明TRV-VIGS系统沉默本氏烟草的ε -LCY基因效 果是显著的（图4)。在ε-LCY基因表达受到抑制的植株（ε-Icy)后，β -胡萝卜素、紫黄 质、玉米黄质含量上升显著，而叶黄素含量出现下降，同时叶绿素 Α和Β含量显著上升，胡萝 卜素的总量上升（图5)。同时，应用定量PCR对类胡萝卜素合成通路上其它基因进行了转 录表达分析，发现除β_胡萝卜素羟基化酶（β-OHase)外，八氢番茄红素合成酶（PSY)，八 氢番茄红素脱氢酶（PDS)，ζ -胡萝卜素脱氢酶（ZDS)，类胡萝卜素异构酶（CRTIS0)，β -番 茄红素环化酶（β -LCY)，玉米黄质环氧化酶（ΖΕ)，紫黄质去环氧化酶（VDE)，新黄素合成酶 (NXS)表达量均显著提高（图6)。在光抑制条件下，对照植株的PSII最大光化学效率（Fv/ Fm)是显著下降的，而ε-Icy烟株表现出色的抵御光抑制能力（图6A)。而植物光合系统 生理状态另一个重要参数非光化学耗散（NPQ)反映植株过剩光能耗散的状态，ε-Icy烟株 NPQ在光抑制条件下显著低于对照植株（图6B)。上述结果表明烟草ε-LCY基因表达受到 抑制后可以增加 β_胡萝卜素分枝色素的含量，进而提高类胡萝卜素物质的总含量，也同 时提高了烟株的叶绿素 Α和Β的含量，使植物的光合能力得到提高，也增强了烟株抵御光抑 制的能力。
[0041] 具体方法如下所述：
[0042] 构建TRV- ε -LCY载体：所用引物为5 ^ -GCGGTACC GTCCTGCTGGTCTTGCTCTTGCT-3 '(包含 ΚρηΙ 酶切位点）和 5 ' -GCCTCGAG GACTCCTGTTTTAGTCATGGGCATG-3'(包含 Xhol 酶切位点）；以 1 中测序正确的 Nt ε -LCY-T 质粒为模版扩增，回收纯化PCR产物，使用ΚρηΙ和Xhol酶切PCR回收片段和TRV2病毒载 体，回收目的片段并连接，转化细菌（DH5a，TaKaRa公司），菌落PCR鉴定阳性克隆，提取质 粒得到目的载体酶切验证并测序。测序正确的TRV2- ε -LCY质粒转化农杆菌，菌落PCR验证 阳性后，注射本氏烟草。具体的分子克隆技术如1中所示。载体图谱和病毒介导的基因沉默 (VIGS，Virus Induced Gene Silencing)操作流程详见参考文献[Hayward A，Padmanabhan M,Dinesh-Kumar SP,Plant Reverse Genetics:Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 678, 55-63]〇
[0043] 病毒载体接种本氏烟草叶片后30天，提取烟草同叶位叶片的RNA并反转录成 cDNA，实时定量PCR分析ε-LCY的沉默效果（相对于未接种的烟草对照和接种带有空病毒 载体的烟草）。ε-LCY沉默效果检测用引物及类胡萝卜素通路转录表达定量PCR引物见表 1〇
[0044] 表1 ε -LCY沉默效果检测引物及类胡萝卜素通路转录表达定量PCR引物
[0045]

【权利要求】
1. 烟草ε -番茄红素环化酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 烟草ε -番茄红素环化酶基因，其编码序列如SEQ ID NO :2所示。
3. 如权利要求1所述的烟草番茄红素环化酶基因的应用，其特征在于：所述烟草 番茄红素 f环化酶基因提高烟草类胡萝卜素含量。
4. 一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，其特征在于：通过瞬时表达技术干扰、沉默 烟草番茄红素 f环化酶基因，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。
5. 如权利要求4所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，其特征在于：以所述烟草番 茄红素 f环化酶基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将特异性核酸片段以正反两个 方向插入到植物表达载体中，构建烟草番茄红素 ε环化酶基因的病毒诱导基因沉默载体 和RNAi载体。
【文档编号】A01H5/00GK104152475SQ201410405714
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】王燃, 史艳梅, 罗朝鹏, 李锋, 刘萍萍, 魏攀, 金立锋, 魏春阳, 杨军, 林福呈, 屈凌波, 武明珠, 陈霞, 郑庆霞 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院