一种碗蕨悬浮细胞培养的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种碗蕨悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞的培养等步骤，本发明方法所制备的碗蕨悬浮细胞增殖率高，生长周期短，遗传稳定性好，为碗蕨药用次生代谢产物的开发和利用提供新的途径。
【专利说明】一种碗蕨悬浮细胞培养的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及碗蕨悬浮细胞培养的快繁方法，属于植物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]礙赢，Dennstaedtiascabra (Wall, ex Hook.) T.1foore,碗厳科,莖红掠色横走，红棕色，密被棕色透明的节状毛，叶疏生；柄长20-35厘米，粗2-3毫米，红棕色或淡栗色，稍有光泽，叶片长20-29- (50)厘米，宽15-20厘米，三角状披针形或长圆形，下部3_4回羽状深裂，中部以上三回羽状深裂，孢子囊群圆形，位于裂片的小脉顶端；囊群盖碗形，灰绿色，略有毛。分布于台湾、广西、贵州、云南、四川、湖南、江西和浙江；尼泊尔，印度，印度支那，日本也有。生林下或溪边，海拔1000-2400米，目前荚果蕨的利用采取野生采集，关于其悬浮细胞的研究更无报道。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种碗蕨悬浮细胞的快速繁殖方法，由该方法所制备得到的碗蕨悬浮细胞增殖率高，生长周期短，遗传稳定性好，为碗蕨药用次生代谢产物的开发和利用提供新的途径。
[0004]本发明所要解决的技术问题是通过以下方案来实现的:
取碗蕨幼嫩叶片，在漂白粉中浸泡2min，流水冲洗12min，水流不宜过大，超净工作台上0.1%氯化萊处理7min,无菌水冲洗5遍，消毒处理过的叶片接种入N6+KTlmg/L+2, 4-D2mg/L+0.5g/L活性炭培养基中进行愈伤组织诱导，附加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，暗室培养，温度20°C，诱导出来的碗蕨愈伤组织接入N6+KTlmg/L+2，4-Dlmg/L进行愈伤组织继代增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.8，光照15001x，温度20°C，增殖后的愈伤组织筛选长势稳定均一的愈伤组织0.5g，接种入液体培养基6，7-V+ ΝΑΑ0.1-0.2mg/L+6-BA0.1-0.2mg/L+Zn2+，Ca2+，Mg2+0.5-2mmol/L中进行悬浮振荡培养，采用搅拌通气式设备，温度22°C，每60ml细胞悬浮液装入250ml锥形瓶中，4_5周后取出，烘干。
[0005]采用本发明制备的碗蕨悬浮细胞增殖率高，生长周期短，产量大，能耗少，利于大规模生产。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
取碗蕨幼嫩叶片，在漂白粉中浸泡2min，流水冲洗12min，水流不宜过大，超净工作台上0.1%氯化萊处理7min,无菌水冲洗5遍，消毒处理过的叶片接种入N6+KTlmg/L+2, 4-D2mg/L+0.5g/L活性炭培养基中进行愈伤组织诱导，附加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，暗室培养，温度20°C，诱导出来的碗蕨愈伤组织接入N6+KTlmg/L+2，4-Dlmg/L进行愈伤组织继代增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.8，光照15001x，温度20°C，增殖后的愈伤组织筛选长势稳定均一的愈伤组织0.5g，接种入液体培养基6，7-V+ NAA0.1mg/L+6-BA0.lmg/L+Zn2+, Ca2+, Mg2+0.5mmol/L中进行悬浮振荡培养,采用搅拌通气式设备,温度22°C，每60ml细胞悬浮液装入250ml锥形瓶中，4-5周后取出，烘干，成活率89%。
[0008]实施例2
取碗蕨幼嫩叶片，在漂白粉中浸泡2min，流水冲洗12min，水流不宜过大，超净工作台上0.1%氯化萊处理7min,无菌水冲洗5遍，消毒处理过的叶片接种入N6+KTlmg/L+2, 4-D2mg/L+0.5g/L活性炭培养基中进行愈伤组织诱导，附加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，暗室培养，温度20°C，诱导出来的碗蕨愈伤组织接入N6+KTlmg/L+2，4-Dlmg/L进行愈伤组织继代增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.8，光照15001x，温度20°C，增殖后的愈伤组织筛选长势稳定均一的愈伤组织0.5g，接种入液体培养基6，7-V+ NAA0.2mg/L+6-BA0.2mg/L+Zn2+，Ca2+，Mg2+2mmol/L中进行悬浮振荡培养，采用搅拌通气式设备，温度22°C，每60ml细胞悬浮液装入250ml锥形瓶中，4-5周后取出，烘干，成活率88%。
[0009]实施例3
取碗蕨幼嫩叶片，在漂白粉中浸泡2min，流水冲洗12min，水流不宜过大，超净工作台上0.1%氯化萊处理7min,无菌水冲洗5遍，消毒处理过的叶片接种入N6+KTlmg/L+2, 4-D2mg/L+0.5g/L活性炭培养基中进行愈伤组织诱导，附加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，暗室培养，温度20°C，诱导出来的碗蕨愈伤组织接入N6+KTlmg/L+2，4-Dlmg/L进行愈伤组织继代增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.8，光照15001x，温度20°C，增殖后的愈伤组织筛选长势稳定均一的愈伤组织0.5g，接种入液体培养基6，7-V+ NAA0.2mg/L+6-BA0.2mg/L+Zn2+, Ca2+, Mg2+0.5mmol/L中进行悬浮振荡培养,采用搅拌通气式设备,温度22°C，每60ml细胞悬浮液装入250ml锥形瓶中，4-5周后取出，烘干，成活率90%。
【权利要求】
1.一种碗蕨悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞的培养，其主要步骤如下: (1)取碗蕨幼嫩的叶片，在超净工作台上对其进行消毒处理； (2)取步骤(I)消毒处理过的叶片接种入N6+KTlmg/L+2，4_D2mg/L+0.5g/L活性炭培养基中进行愈伤组织诱导，附加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，暗室培养，温度20°C ； (3)取步骤(2)中诱导出来的碗蕨愈伤组织接入N6+KTlmg/L+2，4-Dlmg/L进行愈伤组织继代增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.8，光照15001x，温度20°C ； (4)取步骤(3)增殖后的愈伤组织筛选长势稳定均一的愈伤组织接种入液体培养基6，7-V+ NAA0.1-0.2mg/L+6_BA0.1-0.2mg/L+Zn2+，Ca2+，Mg2+0.5_2mmol/L 中进行悬浮振荡培养，4-5周后取出，烘干。
2.按照权利要求1所述的一种碗蕨悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(I)中所述碗蕨无菌叶片的获得为，取碗蕨幼嫩叶片，在漂白粉中浸泡2min，流水冲洗12min,水流不宜过大,超净工作台上0.1%氯化萊处理7min,无菌水冲洗5遍。
3.按照权利要求1所述的一种碗蕨悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(4)悬浮细胞培养中添加了一定浓度的有机离子可以调控愈伤组织中次生代谢物的含量。
4.按照权利要求1所述的一种碗蕨悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(4)愈伤组织的接种量为0.5g，采用搅拌通气式设备，温度22°C，每60ml细胞悬浮液装入250ml锥形瓶中。
【文档编号】A01H4/00GK104170746SQ201410463013
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】杨存 申请人:南京通泽农业科技有限公司