一种红花五味子悬浮细胞的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种红花五味子悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌茎尖的获得、茎尖的破碎、悬浮细胞培养等步骤，本发明所制备的红花五味子悬浮细胞生长速度快，操作可控，培养周期短，易于筛选出次生代谢物含量高的细胞株，利于红花五味子的开发和利用。
【专利说明】 —种红花五味子悬浮细胞的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组培条件下红花五味子悬浮细胞的培养，属于植物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]HJL床予，Schisandra rubrif1ra (Franch.) Rehd.et Wils.,藤本,木兰科，生长于海拔1000-1300米的灌丛中，河谷针阔混交林中，林窗，林中，山谷阔叶林中，山坡灌丛，山坡林缘，山坡林中，山坡杂木林中，疏林中，产于甘肃南部、湖北、四川、云南西部及西南部、西藏东南部。果实治咳喘，自汗，盗汗，遗精，久泻，神经衰弱；藤、茎治风湿性关节炎，目前没有进行人工繁殖，主要进行野外采集，组培方法是对红花五味子进行快速繁殖的有效的方法，有助于其大规模开发和利用。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供红花五味子细胞悬浮培养的快速繁殖方法，操作简单，试验重复性好，细胞繁殖率高等优点，可以规模化的为药厂提供制药原料。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:
取红花五味子的叶片，在洗衣粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗35min，超净工作台上氯化汞处理llmin，无菌水冲洗5-7遍，取消毒处理过的红花五味子的茎尖组织在灭菌过的玻璃匀浆器中研磨，使其软组织破碎，然后将破碎组织接入液体培养基LS+NOA0.2mg/L+ZT0.2mg/L+6mmol/LL-谷氨酰胺+碳酸1丐进行悬浮细胞培养，附加鹿糖20g/L，PH5.8-5.95，光照ΙΟΟΟΙχ，悬浮培养出来的红花五味子细胞接种到无菌固体平板上筛选次生代谢物高产细胞株。
[0005]采用本发明制备的红花五味子悬浮细胞生长速度快，利于大生产操作，能耗小，污染小，操作可控。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
取红花五味子的叶片，在洗衣粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗35min，超净工作台上氯化汞处理llmin，无菌水冲洗5-7遍，取消毒处理过的红花五味子的茎尖组织在灭菌过的玻璃匀浆器中研磨，使其软组织破碎，然后将破碎组织接入液体培养基LS+NOA0.lmg/L+ZT0.lmg/L+5mmol/LL-谷氨酰胺+碳酸1丐进行悬浮细胞培养，附加鹿糖20g/L，PH5.8-5.95，光照ΙΟΟΟΙχ，悬浮培养出来的红花五味子细胞接种到无菌固体平板上筛选次生代谢物高产细胞株。
[0008]实施例2
取红花五味子的叶片，在洗衣粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗35min，超净工作台上氯化汞处理llmin，无菌水冲洗5-7遍，取消毒处理过的红花五味子的茎尖组织在灭菌过的玻璃匀浆器中研磨，使其软组织破碎，然后将破碎组织接入液体培养基LS+NOA0.2mg/L+ZT0.3mg/L+7mmol/LL-谷氨酰胺+碳酸钙进行悬浮细胞培养，附加蔗糖20g/L，PH5.8-5.95，光照ΙΟΟΟΙχ，悬浮培养出来的红花五味子细胞接种到无菌固体平板上筛选次生代谢物高产细胞株。
[0009]实施例3
取红花五味子的叶片，在洗衣粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗35min，超净工作台上氯化汞处理llmin，无菌水冲洗5-7遍，取消毒处理过的红花五味子的茎尖组织在灭菌过的玻璃匀浆器中研磨，使其软组织破碎，然后将破碎组织接入液体培养基LS+NOA0.2mg/L+ZT0.3mg/L+6mmol/LL-谷氨酰胺+碳酸1丐进行悬浮细胞培养，附加鹿糖20g/L，PH5.8-5.95，光照ΙΟΟΟΙχ，悬浮培养出来的红花五味子细胞接种到无菌固体平板上筛选次生代谢物高产细胞株。
[0010]实施例4
取红花五味子的叶片，在洗衣粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗35min，超净工作台上氯化汞处理llmin，无菌水冲洗5-7遍，取消毒处理过的红花五味子的茎尖组织在灭菌过的玻璃匀浆器中研磨，使其软组织破碎，然后将破碎组织接入液体培养基LS+N0A0.2mg/L+ZT0.lmg/L+7mmol/LL-谷氨酰胺+碳酸钙进行悬浮细胞培养，附加蔗糖20g/L，PH5.8-5.95，光照ΙΟΟΟΙχ，悬浮培养出来的红花五味子细胞接种到无菌固体平板上筛选次生代谢物高产细胞株。
【权利要求】
1.一种红花五味子悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、无菌茎尖的破碎、悬浮细胞培养等，主要步骤如下: (1)取红花五味子的茎尖组织，按照常规的消毒方法对其进行灭菌处理； (2)将步骤(I)灭菌处理过的红花五味子茎尖经过破碎接入液体培养基LS+NOA0.1-0.2mg/L+ZT0.1-0.3mg/L+5-7mmol/LL-谷氨酰胺+碳酸钙进行悬浮细胞培养，附加蔗糖 20g/L, PH5.8-5.95，光照 100lx ； (3)取步骤(2)悬浮培养继代多次后的红花五味子细胞接种到无菌固体平板上筛选次生代谢物高产细胞株。
2.按照权利要求1所述的一种红花五味子悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(I)中所述红花五味子无菌茎尖的获得为:取红花五味子的茎尖，在洗衣粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗35min,超净工作台上氯化萊处理7min,无菌水冲洗5_7遍。
3.按照权利要求1所述的一种红花五味子悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(2)中所述红花五味子茎尖的破碎为取消毒处理过的红花五味子的茎尖组织在灭菌过的玻璃匀浆器中研磨，使其软组织破碎，然后将破碎组织进行液体悬浮培养。
4.按照权利要求1所述的一种红花五味子悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(2)所述的红花五味子悬浮细胞按照下述方法得到:取破碎过的红花五味子茎尖接种到盛有60mLLS液体培养基的三角瓶中，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为95r/min,温度 28°C。
5.按照权利要求1所述的一种红花五味子悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(2)中所述的红花五味子悬浮细胞培养中附加了 5mmol/LL-谷氨酰胺和碳酸钙，L-谷氨酰胺可以促进次生代谢物质的合成，碳酸钙作为固体缓冲物质用来调控PH值的稳定。
【文档编号】A01H4/00GK104160963SQ201410462972
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】杨存 申请人:南京通泽农业科技有限公司