L-赖氨酸制品的制备工艺的制作方法
【专利摘要】本发明提供了含L-赖氨酸的制品及其制备方法。所述制品包括包被芯颗粒和包裹在包被芯颗粒上的包被层，其中包被层是过瘤胃脂肪，包被芯颗粒包括赖氨酸盐、填充剂和粘合剂以及任选的谷氨酸钠和任选的木聚糖酶。尤其是本发明还提供了优化的工艺在其中的应用等。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明属于氨基酸领域，具体而言，本发明涉及含L-赖氨酸的制品及其制备方法 和优化工艺等。
【背景技术】
[0002] L-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以 作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工 业中。当前，L-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。
[0003] 然而，当赖氨酸作为饲料的时候，由于其属于小分子营养物质，很快就能释放到动 物体内，尤其在大量摄取时，影响了动物吸收利用的效率。通常解决的方法是少量多次地喂 食动物，但是这将增加动物饲养的工作量。因此，本发明提出了直接用赖氨酸发酵培养液制 备包被的赖氨酸制品的方法，可以有效减缓赖氨酸在动物体内释放的速度。
[0004] 本发明人在前的中国专利201210440083记载了一种包被的赖氨酸的制品，主要 用于饲料。在此基础上，本发明人进行了深入的研究，令人意外地在多个方面，包括工艺方 面、成份(包括微量添加剂)方面和酶改造方面等，均获得了能够提高包被和/或提高利用率 的赖氨酸的制品。
[0005] 发明简述 本发明要解决的技术问题在于提供新的含L-赖氨酸的制品及其制备方法和优化的工 艺在制备其中的应用。另外，本发明还可以提供从该制品优化中获得的各分支发明，包括含 L-赖氨酸的饲料添加剂，少量的谷氨酸钠在制备含L-赖氨酸的饲料添加剂中的应用，和/ 或，突变的木聚糖酶在制备含L-赖氨酸的饲料添加剂中的应用等。
[0006] 优选地，在本发明的一个方面，本发明提供了含L-赖氨酸的制品，其包括包被芯 颗粒和包裹在包被芯颗粒上的包被层，其中包被层是过瘤胃脂肪，包被芯颗粒包括赖氨酸 盐、填充剂和粘合剂以及任选的谷氨酸钠和任选的木聚糖酶。
[0007] 优选其中，赖氨酸盐、填充剂、谷氨酸钠和粘合剂的重量比为40~55 :4~6 :0~2 : 0? 3~0. 8,优选为 42~50 :4. 5~5. 5 :0~1. 5(如 0? 5~1. 5):0. 4~0. 5,更优选为 43~48 :4. 8~5. 2 : 0~1. 2 (如 0? 8~1. 2) :0? 45~0. 55,最优选为 45~46 :5 :0~1 :0? 5。
[0008] 优选其中，包被芯颗粒和包被层的重量比为40~60 :40~60,优选为46~56 :43~53， 更优选为48. 5~51. 5 :48. 5~51. 5,最优选为1 :1。
[0009] 优选其中,赖氨酸盐是赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐或者它们的混合物,优选是赖 氨酸硫酸盐。
[0010] 优选其中，填充剂是微晶纤维素和/或糊精。
[0011] 优选其中，粘合剂是羧甲基纤维素。
[0012] 优选其中，木聚糖酶氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示。
[0013] 优选其中，包被芯颗粒是能通过30目筛并被40目筛截留的颗粒。
[0014] 在另一方面，本发明提供了前述方面的制品的制备方法，其包括： (1) 将赖氨酸盐和填充剂以及任选的谷氨酸钠混合均匀，形成混合物； (2) 向步骤（1)获得的混合物中加入任选含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成 软材； (3 )将步骤（2 )获得的软材过筛(如，30目筛)，形成粗颗粒； (4) 将步骤（3)获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸； (5) 干燥步骤（4)获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒；和， (6) 将过瘤胃脂肪喷在步骤（5)获得的包被芯颗粒上。
[0015] 优选其由步骤（1)、（2)、（3)、（4)、（5)和（6)组成。
[0016] 在另一方面，本发明提供了对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤和/或干燥圆形 微丸并进行筛分(尤其是能通过30目筛并被40目筛截留)的步骤在制备过瘤胃脂肪包被的 含L-赖氨酸的制品的方法中的应用。
[0017] 在另一方面，本发明提供了对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤和/或干燥圆形 微丸并进行筛分(尤其是能通过30目筛并被40目筛截留)的步骤在提高过瘤胃脂肪包被的 含L-赖氨酸的制品的抗降解能力中的应用。
[0018] 优选在这些应用中，过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品是前述方面的制品。
[0019] 优选在这些应用中，制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法是前述方 面的制备方法。
[0020] 发明详述 本发明要解决的技术问题在于提供新的含L-赖氨酸的制品。另外，本发明还可以提供 该饲料添加剂的制备方法以及优化的工艺在制备含L-赖氨酸的饲料添加剂中的应用、少 量的谷氨酸钠在制备含L-赖氨酸的饲料添加剂中的应用，和/或，突变的木聚糖酶及其在 制备含L-赖氨酸的饲料添加剂中的应用等分支发明。
[0021] 一，术语解释 在本文中，术语具有所属领域的技术人员所常规理解的含义。为了清楚起见，本文对如 下术语进行特别说明。
[0022] 在本文中，术语"任选"具有其词典义，即相应被限定的对象被选择或者不选择。例 如，含有任选的谷氨酸钠指的是含有或者不含有谷氨酸钠。又如，任选含有木聚糖酶指的是 含有或者不含有木聚糖酶。
[0023] 在本文中，术语"填充剂"和"粘合剂"分别指的是对非人动物食用安全的分别起 到填充和粘合作用的辅剂，优选地，本文中的"填充剂"和"粘合剂"是食用级（即人食用安 全的)，可以参照相应(人用）食品的指标。
[0024] 在本文中，术语"包含"或"包括"是开放式的表述，即除了所列明包含或包括的成 份之外，可以不再含有其他成分或步骤，但也不排除还含有其他不影响具体列明的成份或 步骤发挥功用的其他成分或步骤。优选地，本文中的"包含"或"包括"优选为"由…组成"。
[0025] 在本文中，如未加特别注明，术语"赖氨酸"指的是L-赖氨酸。
[0026] 二，含L-赖氨酸的制品 在本发明的第二（1)方面，本发明提供了含L-赖氨酸的饲料添加剂，其包括包被芯颗 粒和包裹在包被芯颗粒上的包被层，其中包被层是过瘤胃脂肪，包被芯颗粒的制备方法包 括： (1) 将赖氨酸盐和填充剂以及任选的谷氨酸钠混合均匀，形成混合物； (2) 向步骤（1)获得的混合物中加入任选含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成 软材； (3) 将步骤（2)获得的软材过筛，形成粗颗粒； (4) 将步骤（3)获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸；和 (5) 干燥步骤（4)获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒。
[0027] 优选其中，步骤（1)中的填充剂是微晶纤维素和/或糊精。
[0028] 优选其中，步骤（2)中的粘合剂是羧甲基纤维素。
[0029] 优选其中，步骤（2)中的木聚糖酶氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0030] 优选其中，赖氨酸盐、填充剂、谷氨酸钠和粘合剂的重量比为40~55 :4~6 :0~2 : 0? 3~0. 8,优选为 42~50 :4. 5~5. 5 :0~1. 5(如 0? 5~1. 5):0. 4~0. 5,更优选为 43~48 :4. 8~5. 2 : 0~1. 2 (如 0? 8~1. 2) :0? 45~0. 55,最优选为 45~46 :5 :0~1 :0? 5。
[0031] 优选其中，包被芯颗粒和包被层的重量比为40~60 :40~60,优选为46~56 :43~53， 更优选为48. 5~51. 5 :48. 5~51. 5,最优选为1 :1。
[0032] 优选其中，每克饲料添加剂中木聚糖酶活性为0~30IU，优选为0~15IU(如 5~15IU)，更优选为 0~10IU(如 8~10IU)，最优选为 0~9IU。
[0033] 优选其中，步骤（2)中的筛是30目筛。
[0034] 优选其中，步骤（5)中的筛分是分离获得能通过30目筛并被40目筛截留的颗粒。
[0035] 在本发明的第二（2)方面，本发明提供了本发明的第二（1)方面的饲料添加剂的 制备方法，其包括将过瘤胃脂肪喷在包被芯颗粒上的步骤。
[0036] 优选其包括： (1) 将赖氨酸盐和填充剂以及任选的谷氨酸钠混合均匀，形成混合物； (2) 向步骤（1)获得的混合物中加入任选含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成 软材； (3) 将步骤（2)获得的软材过筛，形成粗颗粒； (4) 将步骤（3)获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸； (5) 干燥步骤（4)获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒；和 (6) 将过瘤胃脂肪喷在步骤（5)获得的包被芯颗粒上。
[0037] 在本发明的第二（3)方面，本发明提供了含L-赖氨酸的制品，其包括包被芯颗粒 和包裹在包被芯颗粒上的包被层，其中包被层是过瘤胃脂肪，包被芯颗粒包括赖氨酸盐、填 充剂和粘合剂以及任选的谷氨酸钠和任选的木聚糖酶。
[0038] 优选其中，制品是饲料添加剂。
[0039] 优选其中,赖氨酸盐是赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐或者它们的混合物,优选是赖 氨酸硫酸盐。
[0040] 优选其中，填充剂是微晶纤维素和/或糊精。
[0041] 优选其中，粘合剂是羧甲基纤维素。
[0042] 优选其中，木聚糖酶氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示。
[0043] 优选其中，赖氨酸盐、填充剂、谷氨酸钠和粘合剂的重量比为40~55 :4~6 :0~2 : 0? 3~0. 8,优选为 42~50 :4. 5~5. 5 :0~1. 5(如 0? 5~1. 5):0. 4~0. 5,更优选为 43~48 :4. 8~5. 2 : 0~1. 2 (如 0? 8~1. 2) :0? 45~0. 55,最优选为 45~46 :5 :0~1 :0? 5。
[0044] 优选其中，包被芯颗粒和包被层的重量比为40~60 :40~60,优选为46~56 :43~53， 更优选为48. 5~51. 5 :48. 5~51. 5,最优选为1 :1。
[0045] 优选其中，每克制品中木聚糖酶活性为0~30IU，优选为0~15IU(如5~15IU)，更优 选为0~10IU(如8~10IU)，最优选为0~9IU。
[0046] 优选其中，包被芯颗粒是能通过30目筛并被40目筛截留的颗粒。
[0047] 优选其中，脂肪优选是棕榈脂肪和/或卵磷脂，更优选是能通过商业途径获取的 产品，如百佳能、百事美等，优选是百佳能HTL316、百事美T300等。在本发明的具体实施方 式中，包被所用的脂肪是百事美T300。
[0048] 如无相反或者矛盾的指示，以上各方面可以优选本方面或者本文中的其他各方面 的内容。
[0049] 三，制备含L-赖氨酸的制品的工艺 在本发明的第三（1)方面，本发明提供了含L-赖氨酸的制品的制备方法，其包括： (1) 将赖氨酸盐和填充剂以及任选的谷氨酸钠混合均匀，形成混合物； (2) 向步骤（1)获得的混合物中加入任选含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成 软材； (3 )将步骤（2 )获得的软材过筛(如，30目筛)，形成粗颗粒； (4) 将步骤（3)获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸； (5) 干燥步骤（4)获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒粒；和， (6) 将过瘤胃脂肪喷在步骤（5)获得的包被芯颗粒上。
[0050] 优选该制备方法制备的含L-赖氨酸的制品是本发明的第二（3)方面所述的制品。
[0051] 优选该制备方法由如下步骤组成： (1) 将赖氨酸盐和填充剂以及任选的谷氨酸钠混合均匀，形成混合物； (2) 向步骤（1)获得的混合物中加入任选含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成 软材； (3 )将步骤（2 )获得的软材过筛(如，30目筛)，形成粗颗粒； (4) 将步骤（3)获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸； (5) 干燥步骤（4)获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒；和， (6) 将过瘤胃脂肪喷在步骤（5)获得的包被芯颗粒上。
[0052] 本发明人发现，对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤和/或干燥圆形微丸并进行 筛分，能够有效提高过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的抗降解能力。所以在接下来的 方面，本发明提供了本发明的第三（1)方面中的步骤（4)和/或步骤（5)的应用。优选其中 抛丸在抛丸机中进行；和/或，筛分用一个或多个特定孔径的筛网进行分离。
[0053] 在本发明的第三（2)方面，本发明提供了对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤在 制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法中的应用。
[0054] 在本发明的第三（3)方面，本发明提供了干燥圆形微丸并进行筛分在制备过瘤胃 脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法中的应用。
[0055] 在本发明的第三（4)方面，本发明提供了对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤在 提高过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的抗降解能力中的应用。
[0056] 在本发明的第三（5)方面，本发明提供了干燥圆形微丸并进行筛分的步骤在提高 过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的抗降解能力中的应用。
[0057] 优选其中，对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤处于(优选紧接于）形成粗颗粒之 后。
[0058] 优选其中，干燥圆形微丸并进行筛分的步骤处于(优选紧接于）将过瘤胃脂肪喷在 包被芯颗粒上之前。
[0059] 优选其中，过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品是本发明的第二（3)方面所述的 制品。
[0060] 优选其中，制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法是本发明的第三（1) 方面所述的方法。
[0061] 优选其中，筛分是分离获得能通过30目筛并被40目筛截留的颗粒。
[0062] 如无相反或者矛盾的指示，以上各方面可以优选本方面或者本文中的其他各方面 的内容。
[0063] 四，谷氨酸钠在含L-赖氨酸的制品中的应用 本发明人发现，少量谷氨酸钠对含L-赖氨酸的制品的抗降解能力是有益的，而且不影 响赖氨酸发挥饲料的作用。所以，本发明还提供了谷氨酸钠在含L-赖氨酸的制品中的应用 和相应方法。
[0064] 在本发明的第四（1)方面，本发明提供了含L-赖氨酸的制品的制备方法，其包括： (1) 将赖氨酸盐和填充剂以及谷氨酸钠混合均匀，形成混合物； (2) 向步骤（1)获得的混合物中加入任选含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成 软材； (3 )将步骤（2 )获得的软材过筛(如，30目筛)，形成粗颗粒； (4) 将步骤（3)获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸； (5) 干燥步骤（4)获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒；和， (6) 将过瘤胃脂肪喷在步骤（5)获得的包被芯颗粒上。
[0065] 优选其中，制品是饲料添加剂。
[0066] 优选其中，步骤（1)中的填充剂是微晶纤维素和/或糊精。
[0067] 优选其中，步骤（2)中的粘合剂是羧甲基纤维素。
[0068] 优选其中，步骤（2)中的木聚糖酶氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0069] 优选其中，赖氨酸盐、填充剂、谷氨酸钠和粘合剂的重量比为42~50 :4. 5~5. 5 : 0? 5~1. 5 :0? 4~0. 5,更优选为 43~48 :4. 8~5. 2 :0? 8~1. 2 :0? 45~0. 55,最优选为 45~46 :5 :1 : 0? 5〇
[0070] 优选其中，包被芯颗粒和包被层的重量比为40~60 :40~60,优选为46~56 :43~53， 更优选为48. 5~51. 5 :48. 5~51. 5,最优选为1 :1。
[0071] 优选其中，每克饲料添加剂中木聚糖酶活性为0~30IU，优选为0~15IU(如 5~15IU)，更优选为 0~10IU(如 8~10IU)，最优选为 0~9IU。
[0072] 优选其中，每克饲料添加剂中木聚糖酶活性为0~30IU，优选为0~15IU(如 5~15IU)，更优选为 0~10IU(如 8~10IU)，最优选为 0~9IU。
[0073] 优选其中，步骤（5)中的筛分是分离获得能通过30目筛并被40目筛截留的颗粒。
[0074] 在本发明的第四（2)方面，本发明提供了本发明的第四（1)方面所述的方法制备 的制品。
[0075] 在本发明的第四（3)方面，本发明提供了谷氨酸钠在制备过瘤胃脂肪包被的含 L-赖氨酸的制品的方法中或者在提高过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的抗降解能力 中的应用。即，本发明提供了谷氨酸钠在制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法 中的应用，本发明还提供了谷氨酸钠在提高过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的抗降 解能力中的应用。
[0076] 优选其中，谷氨酸钠是很少的，例如谷氨酸钠的重量占过瘤胃脂肪包被的含L-赖 氨酸的制品的〇. 5~1. 5%，优选是0. 8~1. 2%，最优选是1%。
[0077] 优选其中，过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品是本发明的第四（2)方面所述的 制品。
[0078] 优选其中，制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法是本发明的第四（1) 方面所述的方法。
[0079] 如无相反或者矛盾的指示，以上各方面可以优选本方面或者本文中的其他各方面 的内容。
[0080] 五，突变的木聚糖酶及其应用 本发明人令人意外地发现了木聚糖酶突变体，其在基本保持原有耐高温特性的基础上 大幅增加了酶活性，特别有益于添加入含L-赖氨酸的饲料添加剂中。
[0081] 在本发明的第五（1)方面，本发明提供了突变的木聚糖酶，其包含突变Arg45Ser， 即第45位氨基酸残基由Arg突变为Ser。
[0082] 优选该突变的木聚糖酶的氨基酸序列 (1) 如SEQIDNo:2 所示；或 (2) 是对SEQIDNo:2缺失、添加和/或取代一个或几个(优选不超过7个，更优选不超 过5个，如不超过3个）氨基酸残基而获得的保留SEQIDNo: 2活性的序列，而且其中包含 突变Arg45Ser。
[0083] 在本发明的第五（2)方面，本发明提供了编码本发明的第五（1)方面所述的木聚 糖酶的基因。
[0084] 优选该基因的核苷酸序列如SEQIDNo: 1所示。
[0085] 在本发明的第五（3)方面，本发明提供了包含本发明的第五（2)方面所述的基因 的载体。
[0086] 在本发明的第五（4)方面，本发明提供了菌种，其包含本发明的第五（2)方面所述 的基因，或用本发明的第五（3 )方面所述的载体转化或者转染而得。
[0087] 优选该菌种是分泌表达菌,如,酵母。
[0088] 在本发明的第五（5)方面，本发明提供了发酵生产本发明的第五（1)方面所述的 木聚糖酶的方法，其包括在发酵条件下培养本发明的第五（4)方面所述的菌种，从培养物中 分离出本发明的第五（1)方面所述的木聚糖酶。
[0089] 在本发明的第五（6)方面，本发明提供了本发明的第五（1)方面所述的木聚糖酶 在制备含L-赖氨酸的制品中的用途。
[0090] 优选其中，每克含L-赖氨酸的制品中本发明的第五（1)方面所述的木聚糖酶活性 为5~15IU，更优选为8~10IU，最优选为9IU。
[0091] 优选其中，制品是饲料添加剂。
[0092] 优选其中，含L-赖氨酸的制品包括包被芯颗粒和包裹在包被芯颗粒上的包被层， 其中包被层是过瘤胃脂肪，包被芯颗粒包括本发明的第五（1)方面所述的木聚糖酶、赖氨酸 盐、填充剂和粘合剂以及任选的谷氨酸钠。
[0093] 更优选其中，赖氨酸盐是赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐或者它们的混合物，优选是 赖氨酸硫酸盐。
[0094] 更优选其中，填充剂是微晶纤维素和/或糊精。
[0095] 更优选其中，粘合剂是羧甲基纤维素。
[0096] 更优选其中，木聚糖酶氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示。
[0097] 优选其中，赖氨酸盐、填充剂、谷氨酸钠和粘合剂的重量比为40~55 :4~6 :0~2 : 0? 3~0. 8,优选为 42~50 :4. 5~5. 5 :0~1. 5(如 0? 5~1. 5):0. 4~0. 5,更优选为 43~48 :4. 8~5. 2 : 0~1. 2 (如 0? 8~1. 2) :0? 45~0. 55,最优选为 45~46 :5 :0~1 :0? 5。
[0098] 优选其中，包被芯颗粒和包被层的重量比为40~60 :40~60,优选为46~56 :43~53， 更优选为48. 5~51. 5 :48. 5~51. 5,最优选为1 :1。
[0099] 优选其中，包被芯颗粒是能通过30目筛并被40目筛截留的颗粒。
[0100] 优选其中，脂肪优选是棕榈脂肪和/或卵磷脂，更优选是能通过商业途径获取的 产品，如百佳能、百事美等，优选是百佳能HTL316、百事美T300等。在本发明的具体实施方 式中，包被所用的脂肪是百事美T300。
[0101] 优选其中，制备的方法包括： (1) 将赖氨酸盐和填充剂以及任选的谷氨酸钠混合均匀，形成混合物； (2) 向步骤（1)获得的混合物中加入含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成软 材； (3 )将步骤（2 )获得的软材过筛(如，30目筛)，形成粗颗粒； (4) 将步骤（3)获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸； (5) 干燥步骤（4)获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒；和， (6 )任选地，将过瘤胃脂肪喷在步骤（5 )获得的包被芯颗粒上。
[0102] 如无相反或者矛盾的指示，以上各方面可以优选本方面或者本文中的其他各方面 的内容。
[0103] 本发明具有以下有益效果：通过多个方面的改进，本发明的制品安全可靠，相对于 现有技术，可更有效降低动物体内赖氨酸的释放速度，抗降解能力更强，更加提高饲料的利 用率而促进动物的生长发育。
[0104] 为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指 出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论 述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
[0105] 另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文 内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复而明确记载过一样。
[0106]
【具体实施方式】
[0107] 以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术 手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验 指南(第3版)》（科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》（高等教育出版社）以及相应仪器 和试剂的厂商说明书等参考。
[0108] 实施例1突变型的木聚糖酶基因的表达构建体的制备 根据我们在前中国专利第201210185883号记载的木聚糖酶基因，将其上编码第45位 的Arg突变成Ser，即将核苷酸序列第133-135位的CGC突变成TCC，突变型的木聚糖酶的 核苷酸序列如序列表的SEQIDNo: 1所示，所编码的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQIDNo: 2 所示。然后，根据《分子克隆实验指南》以及所用商品化试剂的操作指南构建分泌表达的酵 母，简而言之，即将编码该木聚糖酶的基因用正向引物如序列表的SEQIDNo: 3所示（弓丨 入了EcoRI内切酶位点)、反向引物如序列表的SEQIDNo:4所示（引入了NotI内切酶位 点）扩增后用EcoRI和NotI双酶切，并与经这两个内切酶酶切的pPIC3. 5质粒(可购自 Invitrogen公司）用T4DNA连接酶进行连接，转化入大肠杆菌DH5a中。挑出阳性克隆， 抽提出其中的质粒，经测序验证正确后，将阳性质粒用SalI酶切线性化后，通过电转化法 转化入毕氏酵母GSl15株，在含G418的平板上挑出阳性酵母转化株，寄回。
[0109] 实施例2突变型的木聚糖酶的发酵制备及活性测定 将实施例1获得的阳性酵母转化株接种到50mlBMGY液体培养基（IOOmM磷酸钾缓冲 液（pH6. 0)，其中含1%酵母提取物、2%蛋白胨，酵母含氮碱基1. 34%，生物素4*10_5%，葡萄糖 2%，甘油1%)中，于30°C、200rpm培养至0D600达到5. 0。
[0110] 将上述培养物转接到ILBMGY液体培养基中，于30°C、200rpm培养24小时，加入 5ml甲醇，然后继续于30°C、200rpm培养8天，期间每24小时补加5ml甲醇，通气控制溶氧 (DO)大于20%，并控制pH为6.0 (用氨水调节)。培养完成后，用0.22iim滤膜过滤并保留 上清液，该上清液经SDS-PAGE检测其中富含木聚糖酶对应的蛋白质，由此发酵得到木聚糖 酶上清液。
[0111] 取新鲜的上清液，分成三份，一份冷藏待用（A)，一份冷冻干燥至固体后用磷酸 钾缓冲液（PH6.0)重新溶解（B)，一份于80°C烘箱中蒸发干燥至固体后用磷酸钾缓冲液 (pH6. 0)重新溶解（C);对照采用中国专利第201210185883号发现的木聚糖酶基因，用磷酸 钾缓冲液（PH6. 0)溶解后分成三份，一份冷藏待用（CA)，另两份分别冷冻干燥（CB)和80°C 烘箱蒸发干燥（CC)，然后重溶于磷酸钾缓冲液（pH6. 0)。分别测定这些木聚糖酶活性，换算 成原单位体积上清液或单位重量的酶活，计算由于高温脱水造成的酶活损失率，结果如表1 所示，表明相对于原来我们发现的耐高温脱水的木聚糖酶，本发明的突变型的木聚糖酶，虽 然耐高温脱水能力略差于原来的，但是仍旧保留了 75%以上的活性，尤其令人意外的是，酶 活性有了显著的提升，即便经过高温脱水，其酶活性的绝对值仍旧高于原来的木聚糖酶，甚 至高于原来的木聚糖酶在未经过高温脱水时的酶活。
[0112] 表1本发明和市售的木聚糖酶的高温脱水酶活损失率
【权利要求】
1. 含L-赖氨酸的制品，其包括包被芯颗粒和包裹在包被芯颗粒上的包被层，其中包被 层是过瘤胃脂肪，包被芯颗粒包括赖氨酸盐、填充剂和粘合剂以及任选的谷氨酸钠和任选 的木聚糖酶。
2. 权利要求1所述的制品，其中赖氨酸盐、填充剂、谷氨酸钠和粘合剂的重量比为 40~55 :4~6 :0~2 :0? 3~0. 8,优选为 42~50 :4. 5~5. 5 :0~1. 5 (如 0? 5~1. 5) :0? 4~0. 5,更优选 为 43~48 :4. 8~5. 2 :0~1. 2 (如 0? 8~1. 2) :0? 45~0. 55,最优选为 45~46 :5 :0~1 :0? 5。
3. 权利要求1所述的制品，其中包被芯颗粒和包被层的重量比为40~60 :40~60,优选为 46~56 :43~53,更优选为 48. 5~51. 5 :48. 5~5L 5,最优选为 1 :1。
4. 权利要求1所述的制品，其中赖氨酸盐是赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐或者它们的 混合物，优选是赖氨酸硫酸盐；填充剂是微晶纤维素和/或糊精；粘合剂是羧甲基纤维素； 和/或，木聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
5. 权利要求1所述的制品，其中包被芯颗粒是能通过30目筛并被40目筛截留的颗粒。
6. 权利要求1-5之任一所述的制品的制备方法，其包括： (1) 将赖氨酸盐和填充剂以及任选的谷氨酸钠混合均匀，形成混合物； (2) 向步骤（1)获得的混合物中加入任选含有木聚糖酶的粘合剂溶液，混合均匀，形成 软材； (3 )将步骤（2 )获得的软材过筛(如，30目筛)，形成粗颗粒； (4) 将步骤（3)获得的粗颗粒抛丸，形成圆形微丸； (5) 干燥步骤（4)获得的圆形微丸并进行筛分，形成包被芯颗粒；和， (6) 将过瘤胃脂肪喷在步骤（5)获得的包被芯颗粒上。
7. 权利要求6所述的方法，其由步骤（1)、（2)、（3)、（4)、（5)和（6)组成。
8. 对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤和/或干燥圆形微丸并进行筛分(尤其是能通 过30目筛并被40目筛截留)的步骤在制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法中 的应用。
9. 对粗颗粒抛丸以形成圆形微丸的步骤和/或干燥圆形微丸并进行筛分(尤其是能通 过30目筛并被40目筛截留)的步骤在提高过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的抗降解 能力中的应用。
10. 权利要求8或9所述的应用，其中过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品是权利要 求1-5之任一所述的制品；和/或，制备过瘤胃脂肪包被的含L-赖氨酸的制品的方法是权 利要求6或7所述的方法。
【文档编号】A23K1/16GK104472877SQ201410778082
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月17日 优先权日:2014年12月17日
【发明者】孟刚, 马吉银, 陈崇安 申请人:宁夏伊品生物科技股份有限公司