提高红树植物秋茄抗寒能力的方法与流程

技术领域

本发明涉及提高红树植物秋茄抗寒能力的方法，确切地说是利用控制温度的方式来提高秋茄抗寒能力的方法。

背景技术：

红树林是处于热带、亚热带陆地与海洋过渡带的特殊湿地生态系统,是海岸带的生态关键区,具有维护生物多样性、抵抗海啸和台风、调节区域气候等重要生态功能。在全球气候变化条件下，频率和强度不断增加的极端低温天气导致红树林生态系统机制退化，引起了红树林枯黄、落叶，甚至死亡，加剧了红树林湿地的萎缩。因此，急需加强提高红树林抗寒能力的研究，以促进我国东南沿海防护林建设和海岸带生态系统修复。

近年来，由于人类活动和气候变化带来的影响，我国红树林面积仍在不断减少。与20世纪50年代相比，我国红树林面积丧失了73％。随着全球气候变暖越来越明显，红树林分布也产生了变化，人工移植林向更高纬度扩展，这将使原来因为温度限制而无法生长红树林的地带出现红树林。因此，在全球变暖的背景下，扩大红树林向更高纬度种植也将成为增加我国红树林面积趋势之一。

秋茄(Kandelia obovata)是我国既常见又分布最广的红树植物，其人工种植成林最北至浙江省乐清湾西门岛，具有极强的适应能力，已成为我国东南沿海的主要造林树种之一。但越冬期发生的极端低温仍影响着引种秋茄的成活和生长，如2011年初发生的寒害造成温州2008年以后移植的红树植物幼苗大部分死亡，成为我国秋茄红树林向更高纬度人工引种能否成功的主要限制因子之一。因此，如何提高秋茄抗寒能力，维持低温条件下秋茄的存活能力就成为向更高纬度人工造林的瓶颈问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：利用人为精确阶段性降温的方法提高秋茄的抗寒能力，以此提高秋茄在低温环境下的存活率，从而促进秋茄向高纬度的移植进程。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

(a)、在河口或海岸带的滩涂上挖取海泥，除去海泥中的碎石和植物根系后，自然风干敲碎后，装于便于搬运且底部不漏水的栽培容器内，取无损成熟秋茄胚轴插入栽培容器内，浇灌NaCl浓度为10‰的营养液，保持桶内水层1-2cm；

(b)、把插有秋茄胚轴的栽培容器放入人工气候箱，调整人工气候箱的参数为：温度13～15℃(昼)/9～10℃(夜)、相对湿度控制在50％-70％、光照强度大于或等于600μmol·m^-2s^-1，每天昼光照11～13h，培育2～3天，

然后调整人工气候箱的参数为：温度28～30℃(昼)/24～26℃(夜)、光照时间、强度和相对湿度均不变；

(c)、当秋茄胚轴长出两叶一心时，调整人工气候箱的参数为：温度18～21℃(昼)/13～16℃(夜)，培育2～3天，光照和相对湿度均不变，

然后调整人工气候箱的参数为：温度28～30℃(昼)/24～26℃(夜)，光照和相对湿度仍均不变；

(d)、当秋茄胚轴长到四叶一心时，调整人工气候箱的参数为：温度18～21℃(昼)/13～16℃(夜)，光照和相对湿度均不变，培育2～3天，

然后调整人工气候箱的参数为：温度14～16℃(昼)/9～10℃(夜)，光照和相对湿度均不变，培育3～4天，

继续调整人工气候箱的参数为：温度28～30℃(昼)/24～26℃(夜)，光照和相对湿度不变；

(e)、当秋茄胚轴长到六叶一心时，调整人工气候箱的参数为：温度18～21℃(昼)/13～16℃(夜)，光照和相对湿度不变，培育4～5天，

然后调整人工气候箱的参数为：温度14～16℃(昼)/9～10℃(夜)，光照和相对湿度不变，培育4～5天，

继续调整人工气候箱的参数为：温度28～30℃(昼)/24～26℃(夜)，光照和相对湿度不变；

(f)、当秋茄胚轴长到八叶一心时，调整人工气候箱的参数为：温度18～21℃(昼)/13～16℃(夜)，光照和相对湿度不变，培育4～6天，

然后调整人工气候箱的参数为：温度14～16℃(昼)/9～10℃(夜)，光照和相对湿度不变，培育4～6天，

继续调整人工气候箱的参数为：温度9～11℃(昼)/5～6℃(夜)，期间光照强度和相对湿度均不变，培育4～6天，

其中(b)、(c)、(d)、(e)、(f)每个步骤的管理流程分别是：及时补充不含NaCl的营养液，保持水层1-2cm，期间并保证栽培容器晾干2～3天。

以上步骤结束后，秋茄幼苗的抗寒能力已经被提高，可以直接进行低温环境下的实验论证，简称之为低温胁迫，以便观察低温条件对秋茄幼苗的影响。

本发明的技术方案核心构思在于：在保证秋茄育苗效果的同时，育苗过程中不断降低环境温度，来逐步提高秋茄对低温的适应能力，以此提高秋茄的抗寒能力。

将滩涂海泥作为培养介质，主要两方面考虑：第一，海泥接近于秋茄自然生长的条件，且便于培育和试验；第二，低温胁迫(零下温度)时，其它培育方式易结较厚的冰层，尤其是水培，这往往加剧了与红树林生长实际自然环境的差距，缺乏了实践意义，阻碍了该技术的现实应用。

所谓的人工气候箱即是可人工控制温度、相对湿度、光照强度因素的密闭隔离设备，又称可控环境实验室。该人工气候室的其余参数可随意设置环境，不受地理、季节等自然条件的限制并能缩短研究的周期。

本技术方案是在调整为低温环境之前，通过与外界相近的高温来促进秋茄幼苗进行旺盛的光合作用，产生有利于缓解低温胁迫的营养物质(渗透调节物质)，如糖和氨基酸。然后再通过阶段性的梯度降温，可以促进渗透物质的积累，增大束缚水/自由水比值，增加膜脂中不饱和脂肪酸的含量，有效防止生物膜的相变，提高秋茄的抗寒能力。此外，此方法易于操作，能为以后红树植物秋茄向更高纬度移植研究提供可靠的方法途径。

下面结合附图和具体例证作进一步详细说明。

例证

试验材料：秋茄胚轴，从离试验地较近的区域获取，并分为三个处理，分别为TP、TY、WY：

TP是从胚轴开始进行抗寒锻炼直到秋茄长到八叶一心；

TY是育苗前期没有进行抗寒锻炼，秋茄胚轴长到八叶一心时进行抗寒锻炼；

WY是整个育苗期都没有进行抗寒锻炼；

待TP、TY和WY长到八叶一心后，进行相同时间的低温胁迫，然后在适宜温度条件下进行相同时间恢复，进行光合参数测定并采集样品测定光合作用的相关指标。

TP、TY、WY的前期步骤都是相同的：

在河口或海岸带的滩涂上挖取海泥，除去海泥中的碎石和植物根系后，自然风干敲碎后，装于便于搬运且底部不漏水的栽培容器内，土的体积为容器体积的2/3。取无损成熟秋茄胚轴插入容器内，且不宜稠密，浇灌NaCl浓度为10‰的营养液，保持桶内水层1-2cm。

其中，营养液的配置方法是：

(A)、pH值为6.0，浓度82.07g/L的硝酸钙溶液或者浓度118.08g/L的四水硝酸钙溶液；

(B)、pH值为8.0，浓度50.55g/L的硝酸钾溶液或者浓度13.61g/L的磷酸二氢钾溶液或者浓度24.07g/L的硫酸镁溶液或者浓度49.03g/L的七水硫酸镁溶液；

(C)、pH值为5.5，浓度7.46g/L的Nat-EDTA溶液或者浓度5.56g/L的七水硫酸亚铁溶液；

(D)、浓度2.86g/L的硼酸溶液或者浓度1.81g/L的四水氯化镁溶液或者浓度0.22g/L的七水硫酸锌溶液或者浓度0.08g/L的五水硫酸铜溶液或者浓度0.02g/L的钼酸溶液；

然后混合定容至1L，具体的说是将(A)、(B)、(C)、(D)和水分别按10ml、10ml、1ml、1ml、978ml的比例混合，即为全营养液。

营养液的配比也可以是用以下方法，以代替上述第一种营养液使用，对TP、TY、WY的育苗并没有影响：

1.18g/L的Ca(NO₃)₂·4H₂O溶液，0.51g/L的KNO₃溶液，0.49g/L的MgSO₄·7H₂O溶液，0.14g/L的KH₂PO₄溶液，2.86mg/L的H₃BO₃溶液，0.22mg/L的MnCl₂·4H₂O溶液，0.22mg/L的ZnSO₄·7H₂O溶液，0.08mg/L的CuSO₄·5H₂O溶液，0.02mg/L的H₂MoO₄·H₂O溶液，2mL/L的FeEDTA溶液。

(一)、TP的试验步骤是：

(1)、把插有秋茄胚轴的栽培容器放入人工气候箱，调整人工气候箱的参数为：15℃(昼)/10℃(夜)、相对湿度控制在50％-70％、光照强度等于600μmol·m^-2s^-1，每天昼光照12h，培育2天，然后调整人工气候箱的参数为：温度30℃(昼)/25℃(夜)、光照时间、强度和相对湿度均不变；

(2)、当秋茄胚轴长出两叶一心时，调整人工气候箱的参数为：温度20℃(昼)/15℃(夜)，培育2天，光照和相对湿度均不变，

然后调整人工气候箱的参数为：温度30℃(昼)/25℃(夜)，光照和相对湿度仍均不变；

(3)、当秋茄胚轴长到四叶一心时，调整人工气候箱的参数为：温度20℃(昼)/15℃(夜)，光照和相对湿度均不变，培育3天，然后调整人工气候箱的参数为：温度15℃(昼)/10℃(夜)，光照和相对湿度均不变，培育3天，然后调整人工气候箱的参数为：温度30℃(昼)/25℃(夜)，光照和相对湿度不变；

(4)、当秋茄胚轴长到六叶一心时，调整人工气候箱的参数为：温度20℃(昼)/15℃(夜)，光照和相对湿度不变，培育4天，然后调整人工气候箱的参数为：温度15℃(昼)/10℃(夜)，光照和相对湿度不变，培育4天，然后调整人工气候箱的参数为：温度30℃(昼)/25℃(夜)，光照和相对湿度不变；

(5)、当秋茄胚轴长到八叶一心时，调整人工气候箱的参数为：温度20℃(昼)/15℃(夜)，光照和相对湿度不变，培育4天，然后调整人工气候箱的参数为：温度15℃(昼)/10℃(夜)，光照和相对湿度不变，培育4天，然后调整人工气候箱的参数为：温度10℃(昼)/5℃(夜)，期间光照强度和相对湿度均不变，培育4天，

其中(1)到(5)每个步骤的管理流程均是：及时补充不含NaCl的营养液，保持水层1-2cm，即营养液形成的水层始终高出土壤1-2cm，但是(1)到(5)的每个步骤整体期间需要保证栽培容器晾干2～3天，即是每个步骤的培育期间，除了保持营养液水层1-2cm的日期之外，需要额外使栽培容器晾干2～3天，以3天为佳，防止太长时间淹没于营养液对秋茄产生伤害。

(二)、TY的试验步骤是：

(1)、把插有秋茄胚轴的栽培容器放入人工气候箱，调整人工气候箱的参数为：温度30℃(昼)/25℃(夜)，相对湿度控制在50％-70％、光照强度为600μmol·m^-2s^-1，每天昼光照12h。期间，浇灌NaCl浓度为10‰的营养液，保持桶内水层1-2cm，其余时间补充不含NaCl的营养液，并保证每长出一对叶片期间栽培容器晾干2～3天。

(2)当秋茄胚轴长到八叶一心时，采取与TP的步骤(5)相同的措施，即调整人工气候箱的参数为：温度20℃(昼)/15℃(夜)，光照和相对湿度不变，培育4天，然后调整人工气候箱的参数为：温度15℃(昼)/10℃(夜)，光照和相对湿度不变，培育4天，然后调整人工气候箱的参数为：温度10℃(昼)/5℃(夜)，期间光照强度和相对湿度均不变，培育4天。

(三)、WY的试验步骤是：

把插有秋茄胚轴的栽培容器放入人工气候箱，调整人工气候箱的参数为：温度30℃(昼)/25℃(夜)、相对湿度控制在50％-70％、光照强度等于750μmol·m^-2s^-1，每天昼光照12h，直到生长到八叶一心。期间，浇灌NaCl浓度为10‰的营养液，保持桶内水层1-2cm，其余时间补充不含NaCl的营养液，并保证每长出一对叶片期间栽培容器晾干2～3天。

然后将长到八叶一心的TP、TY和WY分别进行低温胁迫，具体来说是放置在温度为5℃(昼)/–2℃(夜)的条件下48h，而三个处理的光照强度参数维持原有不变。然后在适宜温度(30℃(昼)/25℃(夜)条件下恢复72h进行光合参数测定，并采集样品测定光合相关指标。

1测定项目和方法

1.1、叶片颜色的观察

记录低温48h各处理叶片颜色的变化。

1.2、光合参数的测定

将秋茄在自然光照条件下恢复30min,测定光合参数。使用Li-6400型便携式光合仪于10:00-11:30测定选择从顶端向下数的第三对叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)。

1.3、光合色素含量的测定

称取0.1g叶片并将其剪成碎片，置于25ml容量瓶中，加入提取液(1:1的无水乙醇和丙酮)定容，放在黑暗条件下24小时，而后将提取液分离出，分别测定其在470nm、649nm和665nm波长下的吸光值，叶绿素的含量按照公式计算。

1.4、丙二醛(MDA)含量的测定方法

称取剪碎的试材1g，加入2mll0％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA研磨，匀浆在4000r·min-1离心10min，上清液为样品提取液。吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml 0.6％TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450nm波长下的消光度。按照下面公式计算：

MDA含量(μmol/g)＝[MDA浓度(μmol/L)×提取液体积(mL)]/[样品重量(g)×1000]。

1.5、数据处理

采用SPSS 21软件对实验数据进行方差分析和LSD显著性测验，并使用EXCEL 2013制作直方图。

经过上述测定后获得的结果如下：

附图说明

图1是不同处理方式对秋茄叶片净光合速率的影响。

图2是不同处理方式对秋茄叶片气孔导度的影响。

图3是不同处理方式对秋茄叶片蒸腾速率的影响。

图4是不同处理方式对秋茄叶片叶绿素含量的影响。

图5是不同处理方式对秋茄叶片MDA含量的影响。

2、结果与分析

2.1叶片颜色变化

在低温胁迫下，从胚轴开始进行锻炼的幼苗(TP)叶片呈绿色，从幼苗开始进行锻炼幼苗(TY)叶片呈浅绿色，无任何锻炼幼苗(WY)叶片呈微褐色。表明三种处理抗寒能力依次为：TP>TY>WY。

2.2、对秋茄叶片净光合速率的影响

参考图1，在低温胁迫48h时,从胚轴开始进行处理的幼苗(TP)和从幼苗开始处理(TY)叶片净光合速率分别是未经过处理的(WY)的2.0倍和1.54倍，三个处理间比较，均存在显著差异(P<0.05)。在适宜温度下恢复72h后，TP和TY处理仍显著高于WY(P<0.05)，且TP处理显著高于TY处理(P<0.05)。

2.3、对秋茄叶片气孔导度的影响

参考图2，与无任何处理植株相比，低温胁迫48h下TP和TY处理提高了幼苗叶片气孔导度，且分别增加87.8％和35.7％，均存在显著差异(P<0.05)。适宜温度恢复72h后，三种处理条件下叶片气孔导度均增加，但TP和TY处理仍显著高于无任何处理植株(WY,P<0.05)，且TP处理显著高于TY处理(P<0.05)。

2.4、对秋茄叶片蒸腾速率的影响

参考图3，低温胁迫48h时，TP和TY处理下幼苗叶片蒸腾速率被提高，分别是无任何处理植株(WY)的1.85倍和1.33倍，均达到显著差异(P<0.05)。适宜温度恢复72h后，幼苗叶片蒸腾速率均增加，但TP和TY处理仍显著高于无任何处理植株(P<0.05)，且TP处理显著高于TY处理(P<0.05)。

2.5、对秋茄叶片叶绿素含量的影响

参考图4，低温胁迫48h时，TP和TY处理提高了幼苗叶片叶绿素含量，分别是无任何处理植株(WY)的1.68倍和1.28倍，均达到显著差异(P<0.05)。适宜温度恢复72h后，幼苗叶片叶绿素含量均增加，但TP和TY处理仍显著高于无任何处理植株(P<0.05)，且TP处理显著高于TY处理(P<0.05)。

2.6、对秋茄叶片MDA含量的影响

参考图5，低温胁迫48h时，TP和TY处理降低了幼苗叶片MDA含量，分别比无任何处理植株(WY)减少了33.91％和21.78％，均达到显著差异(P<0.05)。适宜温度恢复72h后，幼苗叶片MDA含量均减少，但TP和TY处理仍显著低于无任何处理植株(P<0.05)，且TP处理显著低于TY处理(P<0.05)。

3、结论

净光合速率、气孔导度、蒸腾速率和叶绿素含量是光合作用的主要参数，其数值越大光合能力就越强。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的终产物之一，其含量高低可以作为验证细胞受到胁迫严重程度的指标之一，它的主要伤害是导致膜脂过氧化。从试验数据可知，从胚轴开始进行低温锻炼(TP)和从幼苗低温锻炼(TY)均能提高低温条件下幼苗光合能力，减少低温胁迫对膜脂过氧化的伤害，近而提高低温胁迫下秋茄的抗寒能力，且从胚轴开始进行低温锻炼(TP)的抗寒能力高于从幼苗低温锻炼植株(TY)，而从幼苗低温锻炼植株(TY)的抗寒能力高于无任何锻炼幼苗(WY)。