专利名称：提高作物抗性的化合物及其应用的制作方法
提高作物抗性的化合物及其应用技术领域
本发明属于植物栽培领域，具体而言，本发明涉及提高作物抗性的脯氨酸类化合物、制剂及其在小麦抗寒的应用等。
背景技术：
小麦是世界上最重要的农作物之一，在我国北方以及高海拔地区都有广泛种植，其中冬小麦需要越冬，对抗寒性有一定要求。因此，目前我国推广种植的冬小麦基本都是人工选育的抗寒品种。
对于非抗寒品种，通过施加抗寒/冻剂，可以提高植物的抗寒性，其中也可以用脯氨酸作为植物内源性的抗寒指标。例如，中国专利申请00128262公开了大豆抗寒齐U，其中含有脱落酸等物质，能够提高大豆植株内的脯氨酸含量；又如，中国专利申请200810010789公开了植物抗逆(包括抗冻抗寒)诱导剂，其中含有壳寡糖等物质，能够提高大豆植株内的脯氨酸含量。另外，脯氨酸也可以直接作为外源抗寒成分使用。例如，中国专利02100473公开了抗逆(包括抗寒等多种逆境)保铃型棉花专用叶面喷施剂，在其多种成分中包含少量脯氨酸；中国专利200610155114公开了用于超甜玉米种子的种子包衣剂，在其多种成分中包含少量脯氨酸作为抗寒活性成分；还有，中国专利200910042200公开了用于水稻直播的抗冷型浸种剂，在其多种成分中包含少量脯氨酸作为抗冷剂。然而，对于抗寒品种，尤其是小麦抗寒品种，这些抗寒/冻剂是否能有抗寒/冻效用，现有技术并没有给出启示；另外，由于目前我国推广种植的冬小麦基本都是抗寒品种，也被认为没有必要使用额外的抗寒/冻剂，更没有必要单独施用活性成分仅有抗寒成分的制剂。
经本发明人长期研究和实验发现，目前现有的抗寒小麦品种的抗寒能力主要体现在越冬期，而进入春季返青后，抗寒能力就会急剧下降，此时如果遇到倒春寒气候就会对(抗寒)小麦会造成冻害；而且，提前施用脯氨酸溶液，虽然会有一定效果，但是倒春寒气候一般发生在春季降雨后，脯氨酸容易流失而减效，而在倒春寒气候来临时才进行施用，一来天气难以预测，二是会给农民带来了负担，三是如果加稳定剂容易造成污染。所以，结合本发明人长期研究和实践的经验，令人意外地获得了一种蛋白，能够更稳定地提高(抗寒)小麦的抗寒能力，尤其是在发生倒春寒的时候。发明内容
本发明要解 决的技术问题在于提供新的小麦抗寒的制剂，其能够提高(抗寒)小麦的抗寒能力，尤其是在发生倒春寒的时候。另外，本发明还提供了与之相关的防寒方法、抗寒应用、试验方法以及制备中间体等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了小麦抗寒制剂，其包括脯氨酸类化合物和农学上可接受的辅料。有抗寒需求的小麦多为冬小麦，因此在本发明中，优选小麦是冬小麦。在本文中，“农学上可接受的辅料”指的是不干扰、甚至能增强脯氨酸类似物起效的农用辅料，包括赋形剂、稀释剂、乳化剂、PH调节剂等。在本发明的具体实施方式
中，农学上可接受的辅料是水。这样，可以不使用稳定剂的情况下施用，无论对于成本和污染治理，都是很有益的。优选本发明第一方面的制剂由脯氨酸类化合物和农学上可接受的辅料组成。也就是说，除了脯氨酸类化合物，并且除了农学上可接受的辅料，本发明第一方面的制剂可以不添加其他物质。例如，本发明第一方面的制剂可以由游离的脯氨酸类化合物和农学上可接受的辅料组成。本发明第一方面的制剂中可以直接采用游离的脯氨酸，在某些灌溉方式下，这能够取得不错的抗寒效果。优选采用在本发明的抗寒蛋白，在不受理论限制的情况下，这甚至能在蛋白中脯氨酸量减少的时候增强抗寒效果，说明蛋白质的抗寒效果应该不仅仅来源于(降解产生的)脯氨酸，可能还涉及其他。因此，优选在本发明第一方面的制剂中，脯氨酸类化合物是由氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的抗寒蛋白或其变体提供的。即，本发明第一方面的制剂包含氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的抗寒蛋白或其变体和农学上可接受的辅料。在本文中，抗寒蛋白的变体的氨基酸序列是对SEQ ID No:1缺失、添加和取代一个或几个(优选不超过7个，更优选不超过5个，如不超过3个)氨基酸残基而获得的保留SEQID No:1抗寒活性的序列。本领域技术人员通过重组DNA技术，能够制备出经缺失、添加和/或取代氨基酸残基而获得的变体蛋白。本领域技术人员可以根据蛋白的氨基酸序列推导出其编码的核苷酸序列，优选是密码子优化的核苷酸序列。在本发明的具体实施方式
中，抗寒蛋白是由如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列编码的。更优选在本发明第一方面的制剂中，抗寒蛋白的提供是由核苷酸序列如SEQ IDNo:2所示的基因在酵母中表达而得的上清液提供的。即，本发明第一方面的制剂包含由核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的基因在酵母中表达而得的上清液体和农学上可接受的辅料。这样，无需提纯，进 一步节约了成本。多核苷酸可以通过各种本领域技术人员所熟知的方式被导入菌中，使该菌表达所述多核苷酸编码的蛋白。所述多核苷酸可以直接被导入，例如利用微粒体、基因枪等导入细胞；也可以间接被导入，例如可以通过构建在质粒载体上导入细胞。导入的所述多核苷酸可以整合在细胞的基因组上表达，也可以游离表达。优选本发明中，编码蛋白的多核苷酸可以利用穿梭质粒导入菌中，如抗寒蛋白的多核苷酸可以利用大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒导入分泌表达菌(如毕氏酵母)中，其表达的上清液中含有氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的抗寒蛋白。在第二方面，本发明提供了小麦防寒的方法，其包括在小麦越冬期施用本发明第一方面的制剂。在本文中，抗寒包括在寒冷到来前的预防性抗寒(即，防寒)和在寒冷到来后的补救性抗寒。对于可以预测的冬季寒冷的大趋势，由于目前市售的小麦(冬小麦)都具有一定的抗寒能力，因此只要选择正确适于当地越冬的小麦(冬小麦)品种即可，一般无需额外的防冻剂，因此优选对于倒春寒进行预防。因此优选本发明第二发明的方法是小麦防倒春寒的方法。施用本发明第一方面的制剂的量和次数会随着小麦品种的变化而有所变化，通常以制剂中的脯氨酸计，施用量为1-1OOg/亩，优选为5-50g/亩，更优选为10-20g/亩，可以分f 5次施用，优选分f 3次施用。在第三方面，本发明提供了本发明第一方面的制剂在小麦抗寒中的应用。出于施用的方便和规范性，优选其中抗寒是防寒；出于对倒春寒的预测难度，更优选其中抗寒是防
倒春寒。在第四方面，本发明提供了模拟小麦经历倒春寒的方法，其包括:
(1)在小麦越冬前架设温室支架，同时不封闭温室，使得温室内的温度与环境温度相
同；
(2)在小麦越冬期间封闭温室，使温室内的温度高于环境温度；和，
(3 )在小麦提前返青时重新不封闭温室，使得温室内的温度与环境温度相同。在第五方面，本发明提供了抗寒蛋白或其变体，所述抗寒蛋白的氨基酸序列如SEQID No:1所示，所述抗寒蛋白的变体的氨基酸序列是对SEQ ID No: 2缺失、添加和取代一个或几个(优选不超过7个，更优选不超过5个，如不超过3个)氨基酸残基而获得的保留SEQID No:1抗寒活性的序列。在第六方面，本发明提供了编码本发明第五方面的抗寒蛋白或其变体的基因，优选其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。在第七方面，本发明提供了包含本发明第六方面的基因的载体，优选是大肠杆菌-酵母穿梭载体。在第八方面，本发明提供了菌种，尤其是分泌表达菌(如，酵母)，其包含第六方面的基因，或用第七方面的载体转化或者转染。在第九方面，本发明提供了获得包含本发明第五方面的抗寒蛋白或其变体的上清液的方法，其包括在发酵条件下培养本发明第八方面的菌种，过滤后保留上清液，任选对上清液进行浓缩和/或干燥。在第十方面，本发明提供了本发明第九方面的方法获得的上清液在制备小麦抗寒制剂中的应用，优选在制备本发明第一方面的制剂中的应用。本发明具有以下有益效果:本发明的制剂对植物抗寒/冻剂中一直为人忽视的小麦抗寒重新做了弥补，尤其适用于小麦抗倒春寒，特别是本发明的抗寒蛋白不容易流失而减效，减轻了农民的负担。另外，本发明的抗寒蛋白发酵成本低，过程简单，上清液可以直接(稀释)施用，便于推广。为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发 明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。
实施例1抗寒蛋白的基因的表达构建体 根据我们的设计，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成抗寒蛋白的编码基因，其核苷酸序列如序列表的SEQ ID No:2所示，所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。然后，根据《分子克隆实验指南》以及所用商品化试剂的操作指南构建分泌表达的酵母，简而言之，即将编码该木聚糖酶的基因用正向引物如序列表的SEQ ID No: 3所示(弓丨入了 EcoR I内切酶位点)、反向引物如序列表的SEQ ID No:4所示(引入了 Not I内切酶位点)扩增后用EcoR I和Not I双酶切，并与经这两个内切酶酶切的pPIC3.5质粒(可购自Invitrogen公司)用T4 DNA连接酶进行连接，转化入大肠杆菌DH5 α中。挑出阳性克隆，抽提出其中的质粒，经测序验证正确后，将阳性质粒用Sal I酶切线性化后，通过电转化法转化入毕氏酵母GSl 15株，在含G418的平板上挑出阳性酵母转化株，寄回。
实施例2抗寒蛋白的表达 将实施例1获得的阳性酵母转化株接种到50ml BMGY液体培养基(IOOmM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，其中含1%酵母提取物、2%蛋白胨，酵母含氮碱基1.34%，生物素4*10_5%，葡萄糖2%，甘油1%)中，于30°C、200rpm培养至0D600达到5.0。
将上述培养物转接到IL BMGY液体培养基中，于30°C、200rpm培养24小时，加入5ml甲醇,然后继续于30°C、200rpm培养8天,期间每24小时补加5ml甲醇,通气控制溶氧(DO)大于20%，并控制pH为6.0 (用氨水调节)。培养完成后，用0.22 μ m滤膜过滤并保留上清液，该上清液经SDS-PAGE检测其中对应8kDa的抗寒蛋白(其中脯氨酸含量约占61%)，发现其表量达到7g/L，直接冷冻干燥。使用时，直接用水溶解后稀释成抗寒蛋白水溶液使用。
实施例3小麦抗倒春寒试验 倒春寒这种自然现象的发生难以预测，目前也没有合适的田间模拟试验标准，为此，我们于10月19日播种较新培育的抗寒小麦品种新麦19号，并将地块随机划分成阳性对照、阴性对照、脯氨酸1、脯氨酸2、蛋白I和蛋白2组等6组。其中，阳性对照组的栽培条件(化肥施用等)均参照敦煌种业对所售“ 新麦19号”的说明书，即大田栽培，不搭温室大棚，等到小麦开始返青后(次年2月27日)正常进行水肥管理；其他5组均在播种后搭温室大棚支架，但是不覆盖塑料膜，直至12月6日覆盖塑料膜，控制棚内温度为8-16°C，于次年I月26日小麦开始有返青现象出现时，就提前进行水肥管理(其中阴性对照、脯氨酸I组和蛋白I组采用漫灌，脯氨酸2组和蛋白2组采用喷灌)，并于I月29日揭开塑料膜(此时棚外温度为-3_4°C);另外，脯氨酸I组和脯氨酸2组于I月10日和I月20日各喷洒1.5g/L脯氨酸溶液一次，每亩IOL ;蛋白I组和蛋白2组也于I月10日和I月20日各喷洒含实施例2制备的抗寒蛋白水溶液(以抗寒蛋白计，2g/L，折合脯氨酸含量约为1.2g/L)—次，每亩IOL0观察相对于阳性对照的主茎幼穗冻死率和总产量。
结果如表I所示，相对于没有经历倒春寒的栽培(阳性对照)，经历倒春寒的各组均有不同程度的冻死现象的产生以及产量的下降，其中，没有施用任何抗寒剂的栽培(阴性对照)，冻死率达15%以上，产量下降40% ;而其他施用了脯氨酸或者本发明的抗寒蛋白的，冻死率和产量下降程度都有所减轻，尤其是施用了本发明的抗寒蛋白的，优于直接施用脯氨酸的；另外，灌溉的方式也会影响脯氨酸或者本发明的抗寒蛋白的抗寒效果，采用喷灌更容易影响(尤其对于直接施用脯氨酸的)，这可能是由于本发明的抗寒蛋白具有更佳的附着力而不容易被水(雨水、灌溉水)冲刷流失造成的。表I小麦抗倒春寒试验数据
权利要求
1.小麦(尤其是冬小麦)抗寒制剂，其包括脯氨酸类化合物和农学上可接受的辅料，优选其由脯氨酸类化合物和农学上可接受的辅料组成。
2.权利要求1所述的制剂，其中脯氨酸类化合物是由氨基酸序列如SEQID No:l所示的抗寒蛋白或其变体提供的。
3.权利要求2所述的制剂，其中抗寒蛋白的提供是由核苷酸序列如SEQID No:2所示的基因在酵母中表达而得的上清液提供的。
4.小麦(尤其是冬小麦)防寒的方法，其包括在小麦(尤其是冬小麦)越冬期施用权利要求1-3之任一所述的制剂。
5.权利要求1-3之任一所述的制剂在小麦(尤其是冬小麦)抗寒中的应用。
6.权利要求5所述的应用，其中抗寒是防寒，优选是防倒春寒。
7.模拟小麦(尤其是冬小麦)经历倒春寒的方法，其包括: (1)在小麦(尤其是冬小麦)越冬前架设温室支架，同时不封闭温室，使得温室内的温度与环境温度相同； (2)在小麦(尤其是冬小麦)越冬期间封闭温室，使温室内的温度高于环境温度；和， (3)在小麦(尤其是冬小麦)提前返青时重新不封闭温室，使得温室内的温度与环境温度相问。
8.抗寒蛋白或其变体，所述抗寒蛋白的氨基酸序列如SEQID No:1所示。
9.编码权利要求8所述的抗寒蛋白或其变体的基因，优选其核苷酸序列如SEQIDNo:2所示。
10.获得包含权利要求8所述的抗寒蛋白或其变体的上清液的方法，其包括在发酵条件下培养分泌表达菌(如，酵母)，过滤后保留上清液，任选对上清液进行浓缩和/或干燥，优选其中分泌表达菌(如，酵母)包含权利要求9所述的基因，或者用包含权利要求9所述的基因的载体(如，大肠杆菌 -酵母穿梭载体)转化或者转染。
全文摘要
本发明提供了提高小麦(尤其是冬小麦)抗性(尤其是抗寒)的化合物及其制剂，其包括脯氨酸类化合物，能用于小麦的防寒，如防倒春寒。另外，本发明还提供了相关的防寒方法、抗寒应用、试验方法以及制备中间体等。
文档编号A01P21/00GK103141498SQ20131006001
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月26日 优先权日2013年2月26日
发明者何其明 申请人:成都新朝阳作物科学有限公司