选育耐储高产优质的大葱新品种的方法与流程

本发明涉及遗传育种领域，具体地说，涉及一种选育耐储高产优质的大葱新品种的方法。

背景技术：

大葱为百合科葱属植物，起源于中国西部及苏联的西伯利亚，由野生葱在中国驯化和选择而来，中国是栽培大葱的主要国家，也是大葱的起源地，后经朝鲜传入日本，1583年传入欧洲，19世纪传入美国，但欧洲、美国栽培极少，世界大葱种植面积900万亩，我国占810万亩。

随着产业化道路的发展，大葱生产存在的一些问题逐渐显现出来:首先，储存损失率过高，绝大部分葱叶损失掉，特别是冬储葱损失更为严重，经试验测算不同品种葱叶占55-65％；其次，优良品种少，生产上用的品种多为常规种或其改良系和农家自留种，整齐度差，商品性差，产量低、抗逆性差，耐贮性不高，货架期短；再次，标准化程度低，缺乏高效的配套栽培技术，不能发挥出品种的高产潜力，大部分菜农采取传统种植方式，接受能力差，对科学种植技术的掌握程度较低，难以实现高产、高效的现代农业发展之路。

我国大葱育种大多采用传统的常规选育，长期以来一直是蔬菜育种的一个薄弱环节，滞后于其它蔬菜。由于广泛引种、自繁、繁种技术不规范等导致品种混杂，种性退化，群体整齐度差和抗性差，在抗逆性和品质方面不能满足生产和市场需要。加强大葱育种研究已成为当务之急。由于大葱花器小，单花结籽率低，人工去雄成本高，因而利用雄性不育系配制杂交种是最为有效的途径之一。

技术实现要素：

本发明针对大葱育种及生产中存在的问题，确立了建立高效的雄 性不育育种技术评价、筛选体系，创新种质资源，选育耐储(葱白葱叶比高)、高产、抗病、抗逆性强、适合多季栽培的三系杂交大葱新品种为育种目标。

为了实现本发明目的，本发明提供一种选育耐储高产优质的大葱新品种的方法，技术路线如下：

资源的收集整理→资源的鉴定、创新种质资源→三系的加代纯化→建立不育系和保持系的评价、筛选技术体系→组配新组合→F1的大田生产鉴定、栽培试验→获得耐储高产优质的大葱新品种。

本发明选育耐储高产优质的大葱新品种的方法包括以下步骤：

S1、以‘青叶1号’大葱为材料，建立大葱不育系育种圃，选育大葱雄性不育系和保持系，建立优质大葱雄性不育系评价和筛选体系；

S2、从不同性状的大葱资源中进行单株自交、定向选择培育稳定纯合的父本系，并进行综合性状鉴定，选育出优良父本系；

S3、利用S1获得的雄性不育系与S2选育出的父本系杂交，配制杂交组合，通过对其后代耐储性、丰产性、抗逆性的鉴定，选育出大葱新品种。

S1具体如下：

S11、不育株的选育

在青叶1号大葱繁种田中，筛选大葱雄性不育单株，任其自由授粉，根据大葱子代不育株育性表现不同，筛选出不育率最高的优良不育株；

S12、保持株的选育

在青叶1号大葱繁种田中，选择育性正常、花粉充足的优良单株，与S11所选的不育率最高的不育株成对测交并自交，作为保持株；

S13、不育系、保持系配对选育

从不育株上收获的种子为T系，从可育株上收获的种子为S1系， 选留不育株率高的T系和可育株率高的S1系，分别回交、自交，分株收取回交后代BC1及轮回父本种子，选留不育株率高和可育株率高的单株，再分别进行回交、自交，以此类推，直至选育出优质大葱雄性不育系和保持系。

其中，S13鉴定育性的同时，利用雄性不育系采用“一父多母”的方式配制杂交组合。

S1中雄性不育系的判定标准如下：①花药绒毡层细胞提早液泡化并解体，解体时间始于花粉母细胞时期，到单核花粉粒时期几乎完全消失，不能为小孢子发育提供必需的营养物质；②绒毡层细胞内的原生质浓度低，无明显的多核现象，该绒毡层细胞的异常也造成营养物质供应不足，引起花粉粒败育；③在单核花粉粒到成熟花粉粒发育过程中，有些花药的药隔细胞纤维化，阻碍了水分和营养物质由维管束向花粉囊的输送，从而引起花粉粒败育。

S1中利用引物组合nad5和cox2鉴定优质大葱雄性不育系和保持系；

用于PCR扩增nad5基因的特异性引物对为(SEQ ID NO:1-2)：

nad5F：5′-ATCTCTGAGGATCCGCATAGC-3′

nad5R：5′-ACATCGTAACCTGTCTCGC-3′

用于PCR扩增cox2基因的特异性引物对为(SEQ ID NO:3-4)：

cox2F：5′-CGATTCCAGAAGATGATCCAG-3′

cox2R：5′-GGATACCCGAGAACCATAATC-3′

前述的方法，S1中选育出的优质大葱雄性不育系为‘08青601A’。

前述的方法，S1中选育出的优质大葱雄性不育系为‘08青601B保持系’。

引物对nad5可以在08青601B保持系中扩增出约1180bp大小的条带，而08青601A不育系中没有。引物对cox2可以在08青601B保持系中扩增出约1750bp和约380bp两条带，而08青601A不育系中没有。

前述的方法，S2中所述大葱资源包括‘宗正葱王’等。

前述的方法，S3中还包括采用分组轮配法进行配合力的测定：将雄性不育系归为母本组，同一父本与各雄性不育系配组杂交，同一雄性不育系作为母本与多个父本配组杂交。

本发明首次建立了高效的雄性不育育种技术评价、筛选体系，创新种质资源，选育耐储(葱白葱叶比高)、高产、抗病、抗逆性强、适合多季栽培的三系杂交大葱新品种，为优质大葱新品种的选育提供了技术支持。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中不育系和保持系的雄蕊形态及花粉粒活力；其中，A:a为不育系雄蕊，b为保持系雄蕊；B:a为不育系干瘪的花药，b为保持系花药。

图2为本发明较佳实施例中保持系和不育系的成熟花粉粒形态及活力；其中，A-B:保持系花粉粒形态及活力；C:不育系花粉粒形态及活力。

图3为本发明较佳实施例中不育系和保持系花药的显微结构；其中，A：不育系花粉母细胞早期(400×)；B：不育系花粉母细胞后期，箭头示绒毡层细胞液泡化(400×)；C：保持系花粉母细胞至减数第一次分裂期，箭头示发育正常的绒毡层细胞(400×)；D：不育系减数分裂期，箭头示正在解体的绒毡层细胞(400×)；E：保持系减数分裂期，箭头示正常的绒毡层细胞(400×)；F-H：不育系幼嫩花粉粒期，F、G(400×)，H(200×)；I-K：保持系幼嫩花粉粒期(400×)；L：不育系成熟花粉粒期(400×)；M：不育系药隔细胞纤维化(100×)，左下方为放大的纤维化药隔细胞(400×)；N：不育系空瘪花粉粒(400×)；O：保持系成熟花粉粒(400×)。

图4为本发明较佳实施例中不同引物在08青601A和08青601B上的扩增结果；其中，①orfA501②atp1③atp6④nad5⑤cox2⑥cox3⑦rrn26。

图5为本发明较佳实施例中选育耐储高产优质的大葱新品种的技术路图线。

图6为本发明较佳实施例中不育系保持系选育过程图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例选育耐储高产优质的大葱新品种的方法

以青叶1号大葱为基础材料，建立大葱不育系育种圃，创新大葱种质资源，选育大葱雄性不育系和保持系，建立优质大葱雄性不育系评价和筛选体系。从国内外收集的不同性状大葱资源中进行单株自交、定向选择培育稳定纯合的父本系，并进行综合性状鉴定，选育出优良父本系。按照育种目标，利用不育系与父本系杂交，配制杂交组合。通过对其后代耐储性比较、丰产性比较、抗逆性等鉴定，鉴定出优异组合，进而选育出符合育种目标的大葱新品种(图5)。

(一)育种技术研究

由于大葱花器官小，单花结籽率低，人工去雄成本高，因而利用雄性不育系配制杂交种是最为有效的途径。而雄性不育系的评价和快速筛选可以大大减少工作量、提高育种效率。

本发明在实施过程中，针对项目组的大葱种质资源，构建了从形态学到细胞学再到分子标记辅助选择再至雄性不育系的配合力测定的评价和筛选体系。

1、形态学

(1)植株形态

不育系08青601A：株高105cm，葱白48.2cm，粗3.1cm，叶片直立，叶色深绿，叶面蜡粉多，田间生长健壮。高抗大葱紫斑病、霜霉病、病毒病。退化慢，抗性强。具有优良的高产优质性状。

(2)花药形态

大葱雄性不育系08青601A雄蕊有正常的花药和花丝，花药外形表现为干瘪不开裂，无花粉粒散出(图1)。此特征适合于该雄性不育系的初步田间快速鉴定。

2、细胞学

(1)花粉粒活性的测定

该不育系花粉囊不开裂，花药内含有花粉粒，但花粉粒无活性(图2)，属于花粉败育类型的不育系，该特征有利于田间快速鉴定雄性不育。

(2)雄性不育系花药发育的细胞学特征

除了在形态学上鉴定外，从细胞学的角度将不育系和保持系进行了对比观察。不育系的花药结构特征如下：①花药绒毡层细胞提早液泡化并解体，解体时间始于花粉母细胞时期，到单核花粉粒时期几乎完全消失，不能为小孢子发育提供必需的营养物质；②绒毡层细胞内的原生质浓度低，无明显的多核现象，该绒毡层细胞的异常也造成营养物质供应不足，引起花粉粒败育；③在单核花粉粒到成熟花粉粒发育过程中，有些花药的药隔细胞纤维化，阻碍了水分和营养物质由维管束向花粉囊的输送，从而引起花粉粒败育。不育系和保持系花药发育比较结构图(图3)。

3、分子标记辅助选择08青601A不育系和08青601B保持系

前人普遍认为，细胞质雄性不育系(CMS)的发生，与线粒体基因组的分子间或分子内频繁重组而形成的嵌合基因有关。

本发明根据线粒体基因组的部分基因(nad5、cox2、cox3、atp1、atp6、rrn26、orfA501、SCS13、SCS200)并参考王婵、吴海涛等的方法，合成引物对，经过PCR扩增，筛选到2对引物(nad5和cox2，扩增nad5基因的特异性引物对如SEQ ID NO:1-2所示，扩增cox2基因的特异性引物对如SEQ ID NO:3-4所示)可以鉴定08青601A不 育系和08青601B保持系。Nad5(NADH脱氢酶5)可以在08青601B保持系中扩增出约1180bp的条带，而不育系中没有。Cox2(细胞色素c氧化酶2)可以在08青601B保持系中扩增出约1750bp和约380bp两条带，而08青601A不育系中没有(图4)。

利用这两个引物可以快速鉴定08青601A不育系和08青601B保持系。

(二)种质资源的收集与鉴定

收集不同类型的国内外大葱资源26份，并与原有的资源一起种植，鉴定其丰产性、抗病性、抗逆性等，筛选出优良的育种材料。进行分类、整理、保存，并针对育种目标，将这些资源进行纯化选种及变异材料保留创新。利用多年种植大葱的地块创建大葱自然病圃，采用治虫不治病的方法，对优良抗病的材料和抗病单株进行有效的选择。

针对育种目标，对收集的材料进行了筛选与鉴定。不同的品种资源种植在一致的栽培条件下，使之充分表现彼此的差异。为了使不同品种群的园艺性状充分显现，我们进行分区种植，采取相应的栽培技术措施。长白类型品种行距75㎝左右，3次培土，短白和鸡腿类型品种行距60㎝左右，2次培土。在整个植株生长过程中从大葱的植株、叶、假茎、花等不同的生长阶段多次进行筛选、鉴定。

大葱的主要产品是葱白，它在田间掩盖在培土之中，不能全面检测，成株商品采收后，进行田间考种鉴定。

(三)新品种选育

1、大葱雄性不育系的选育

1.1不育株的选育

2006年在青叶1号大葱繁种田中，发现12株大葱雄性不育单株，分别挂牌编号为06田青CA-1、06田青CA-2……06田青CA-12，任其自由授粉，经自然授粉后，按编号分别收获保存。同年将收获的单株7月中旬育苗，10月露地网棚定植。2007年5月上旬大葱开花期 调查发现，所选12株大葱不育株育性表现不同，其中06田青CA-2表现不育率最高达95％，其它被淘汰。

1.2保持株的选育

2006年从大葱制种田中选12株育性正常、花粉充足的优良单株，摘除已开放的花，套袋自交，分别收获编号。2006年7月播种，10月定植露地网棚。2007年5月大葱开花时选优良单株，摘除已开放的花挂牌套袋，与所选的不育株成对测交并自交，作为保持株。

1.3不育系、保持系配对选育

2007年从06田青CA-2选50株优良不育株摘除已开放的花，挂牌套袋，从2007年所选的12株可育单株后代中，选花粉量充足的可育单株，摘除已开放的花，挂牌套袋，3-4天后，刷取花粉给所选的不育株成对授粉(测交T)，每天1次，种子成熟后单株收获种子，从不育株上收获的种子为T系，从可育株上收获的种子为S1系。

同年将收获的种子分两部分处理：一部分7月份育苗，一部分10月份育苗。7月育苗的大葱于10月份将T系和S1系成对定植到露地网棚，次年5月开花时作育性鉴定，分别调查T系和S1系不育和可育株率，选留不育株率高的T系和可育株率高的S1系，入选株系中各选50株，分别回交、自交，分株收取回交组合(BC1)及轮回父本种子(S2)。10月育苗的大葱于2008年6月将2007年7月育苗次年5月育性调查不育株率高和可育株率高的成对组合定植大田中，其余的淘汰。2008年11月进行田间考种、成株鉴定，淘汰田间生长劣势的株系。并从成对的大母株中选择优良的或变异的不育株和保持株组对并定植露地网棚。2009年5月作育性鉴定选择。以后年份以此类推(图6)。

2012年在育种圃选育出花药退化无花粉，不育率接近100％，叶片直立、叶色绿或深绿、抗病、抗逆性等综合性状优良的大葱雄性不育系4对，‘08青601A’、‘08青353A’、‘04青备C3A’、‘04青备C9A’以及相配套的保持系08青601B’、‘08青353B’、‘04青备C3B’、‘04青备C9B’(表1、表2)。

表1不育系、保持系主要性状调查表

表2大葱不育系08青601A不育率及相应保持系的可育率调查表

鉴定育性的同时利用雄性不育系采用“一父多母”的方法配制杂交组合，并进行杂交组合的鉴定及有选择的小面积制种，安排多地多点适应性鉴定。

1.4大葱雄性不育系的特征特性

不育系08青601A：株高105cm，葱白48.2cm，粗3.1cm，叶片直立，叶色深绿，叶面蜡粉多，田间生长健壮。高抗大葱紫斑病、霜霉病、病毒病。退化慢，抗性强。

2、大葱父本系的选育

2.1选育经过

2006年开始大葱父本系的选育。采用自然病圃抗病性鉴定和单株定向选择相结合方法。根据育种目标从育种圃和引进的国内外大葱资源中，选出20个性状优良的株系(自交1代以上)，各选择10株， 10月份定植大田露地网棚，5月份开花时，人工套袋自交授粉，单株收获，收获后的种子10月份育苗，07年6月份定植大田。每个株系定植200株以上，07年11月份大田考种、鉴定，严格选择，淘汰性状不符合育种目标的株系78个，剩余22个入选，并将这22个株系严格去劣选优，从植株的形状，葱白长短，粗细，抗病性，整齐度，葱白的松紧度等优中选优，每个株系留8-10株，于10年3月份定植露地网棚中。5月份大葱开花时，人工套袋自交授粉，种子成熟后分别收获。此时的种子已经过了3代以上的选育，有的已趋向稳定，此时为了加快育种进度，提高其生活力(每代自交生活力基本都有衰退现象)采用小母株加代繁殖。将收获的种子分两部分，一部分11年7月份育苗，一部分10月份育苗，7月份育苗的种子，11年11月份定植露地网棚，12年5月份开花时各株系选6株进行套袋授粉，10月份育苗的12年6月份定植大田，11月份田间鉴定，根据植株的长势，叶片数，假茎长短、粗细，紧实度、抗性等性状定向选育，优中选优，培育出符合育种目标综合性状优良的高代自交系9个(表3)。

表3自交系主要性状调查表

2.2父本系的特征特性

父本08-21-3-7：来源山东品种宗正葱王，株高115cm，葱白长59.6cm，白粗3.3cm，葱白紧实；管状叶5-6枚，叶片绿色，叶长58cm。口感脆甜，生长速度快，抗寒耐热，耐涝性好。

3、杂交大葱新品种的选育

3.1选育经过

2012年在进行不育系、保持系和父本系加代提纯筛选的同时，采用分组轮配法进行了配合力的测定，即将雄性不育系归为母本组，自交系归为父本组，同一父本与各雄性不育系配组，同一雄性不育系作母本与多个父本自交系组配，筛选出符合育种目标的杂交组合。

2013年对所配制的36个杂交组合在本所试验田进行初步鉴定，编号为13-26的组合表现突出。该组合母本为大葱雄性不育系08青601A，父本系为高代自交系08-21-3-7，定名为‘青杂3号’。该品种整齐度高、叶片深绿、叶面蜡质层厚、叶片直立，高产、抗病、抗逆性突出，适应性强。

3.2选育结果

3.2.1耐储性

耐储性的鉴定：同一块鉴定田种，按统一标准，分别对、青杂3号和寒丰巨葱各选取均匀的15株，整理后称重，测葱白葱叶比后，将样品置于背阴自然条件下，用土埋住葱白，分两次分别称重，计算损耗率(表4)。

青杂3号葱白葱叶比较对照高10％。

表4葱白葱叶比测试结果(三次重复平均数)

在冬储试验中青杂3号的损耗在27.1，对照品种为44.7％。明显低于对照品种。(表5)

表5大葱冬季储存试验实验结果(三次重复平均数)

丰产性好：2014-2015年一方面在本地进行品比试验，另一方面在石家庄赞皇、邯郸磁县、河南新乡进行多点生产试验。10月3号育苗，翌年6月12号定植，同一地块，相同的管理，对照品种均为山东章丘大葱品种-寒丰巨葱。‘青杂3号’大葱在株高、横茎、纵茎、单株重量均明显优于对照品种。品比试验设3次重复，随机排列，结果表明青杂3号比对照品种连续2年均增产，增产幅度为19.7-21.1％(表6)，生产试验采用随机排列，三点取平均数(每点15㎡)，‘青杂3号’连续2年在3个试验点均比对照增产，增产幅度为17.8-21.2％。(表7)。生产试验的同时开始推广工作，种植专业合作社和种植户一致认为该大葱整齐度高，生长旺盛，葱叶深绿，抗病、抗逆性强，比当地主栽品种增产显著。

表6青杂3号大葱品比试验结果

表7青杂3号大葱生产试验产量

3.2.2抗病性强

2014-2015年大葱品比试验中对‘青杂3号’的抗病性进行了调查，其结果是：青杂3号霜霉病、紫斑病和病毒病的发病率和发病指数明显低于对照品种寒丰巨葱，表现超强的抗病力，高抗大葱霜霉病、紫斑病和病毒病(表8)。

表8大葱抗病性统计结果

注：调查株数为100株。

3.2.3抗倒、耐涝性好

在2014年多风、多雨的天气条件下调查，调查地点为赞皇县土门乡千根村。在大葱种植集中地块，选取中等管理水平地块，随机取样，每块地取三点，每点取100株。结果表明(表9)：‘青杂3号’的抗倒性较对照品种--寒丰巨葱倒伏率低10％。

多雨的条件下能正常生长，霜霉病、紫斑病、病毒病等多种病害发生极少量。对照品种寒丰巨葱霜霉病、紫斑病、病毒病等病发生较严重。

表9青杂3号抗倒性调查表

3.2.4适应性强

‘青杂3号’可作为春葱、夏葱、伏葱、秋葱及冬贮大葱栽培，并具备了作为冬贮葱的生长良好，抗逆性突出，耐储，产量高等特点。

3.2.5新品种的特征特性

该品种整齐度高，植株高大，生长势强，生长速度快；叶片直立，叶色深绿，管状叶6枚，叶面蜡粉厚，抗风、抗倒力强。叶身上冲或稍斜伸，叶肉较厚；株高150cm，葱白长55-70cm，粗4cm左右，叶长70cm左右,单株重0.45-0.55kg，葱白葱叶比14:11；质地紧密，脆嫩，味甜，平均亩产7502.6kg，比对照增产19.6％；抗寒耐涝，高抗紫斑病、病毒病、霜霉病，适应性强，栽培地区广，适合四季栽培，更是冬储葱栽培的理想品种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

王婵.大葱雄性不育系的显微观察和相关DNA片段筛选[D].山西大学硕士学位论文,2013吴海涛,王建军,侯喜林,刘洪炯,马蓉莉,马景蕃.两个洋葱雄性不育系细胞质类型的鉴定与分析[J].园艺学报,2009,36(5):723-726 。