一种翅果油树定芽增殖与植株再生方法与流程

本发明属于林木组织培养技术领域，具体涉及一种翅果油树定芽增殖与植株再生方法。

背景技术：

翅果油树(Elaeagnusmollis Diels)，为胡颓子科胡颓子属多年生落叶乔木或灌木，是第四纪冰川幸存的中国特有的古老植物种。翅果油树种子油营养丰富、均衡、全面，富含多不饱和脂肪酸，其中亚油酸含量高达45％，亚油酸是一种人和动物体自身不能合成而必须从食物中摄取的不饱和脂肪酸，具有预防高血压、高血脂、血管硬化等病症的功能。翅果油树种仁中维生素E的含量尤为惊人，高达1558.1mg/100g。维生素E与人体的生长发育密切相关，有着显著的抗氧化、抗衰老作用。翅果油树叶中富含黄酮类化合物，可为心血管类疾病药物研制提供来源。此外，因其花蜜量大，材质细密坚实，根系发达并具有根瘤固氮活性，在蜜源植物、用材林栽培，水土保持、改善土壤肥力方面，翅果油树也具有一定的应用前景。

过去由于对翅果油树缺乏正确的认知和可持续性利用意识，人类的砍伐、垦荒以及大规模无限制的直接采摘野生翅果油树种子榨油等生产活动对翅果油树的自然群落产生了严重干扰破坏。除了人为因素外，翅果油树自身脆弱的生物学特性如自然生境狭窄；结实率低，易发育不良；自然条件下，种子寿命短，发芽率低等也加剧了其种群的濒危。因此，有必要采取措施恢复、扩大翅果油树种群，从而保护这一重要的遗传资源和优良的珍稀油料树种，充分利用其经济、生态和科研价值。

翅果油树的繁育通常有种子繁殖和分根繁殖。但翅果油树自然条件下种子寿命短，发芽率低，而分根繁殖存在繁殖系数不高的问题。组织培养是一项已广泛应用于生产实践的生物技术，但翅果油树组织培养过程中诱导愈伤及不定芽时易发生褐化，本方法则避开这一难题，利用翅果油树叶腋处易萌发新芽的特点，采用定芽增殖的方法，促进腋芽萌发、伸长，实现植株再生。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种翅果油树定芽增殖与植株再生方法，避开传统的翅果油树组织培养方法中愈伤及不定芽诱导过程中易出现褐化的问题，实现翅果油树无性繁殖。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种翅果油树定芽增殖与植株再生方法，包括以下步骤：

(1)选取发育良好的成熟翅果油树果实，剥去外层坚硬果壳，进行清洗、消毒、无菌处理；然后在解剖镜下去除内层种皮，置于3/4MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基，获得腋芽饱满、健壮的实生苗；

(2)将获得的实生苗剪成带有2～4个腋芽或顶芽，长3～4cm的茎段，水平接种于3/4MS+TDZ 0.006～0.008mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基，处理7～10d；

(3)将步骤(2)获得的茎段竖直接种于3/4MS+BA0.4～0.5mg/L+NAA0.05～0.07mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基培养，20d时继代一次；

(4)待步骤(3)中定芽伸长到6cm以上，具有一定木质化程度后，接种于生根培养基1/2MS+IBA 1.5mg/L+NAA 0.01～0.03+蔗糖25g/L+琼脂7g/L中继续培养，进行生根诱导；最终获得小苗。

步骤(1)中，以少量洗洁精和84消毒液浸泡10min并流水冲洗1h后，于超净台中用70％酒精浸泡40s，再以适量0.1％升汞并少量Tween～20，振荡浸泡20min，无菌水冲洗4～5次。

步骤(3)中，培养基为3/4MS+BA 0.5mg/L+NAA0.05～0.07mg/L。

步骤(4)中，生根培养基为1/2MS+IBA 1.5mg/L+NAA 0.01～0.03mg/L+KT 0.01mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7g/L。

步骤(4)中，生根培养基为1/2MS+IBA 1.5mg/L+NAA 0.03mg/L+KT 0.01mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7g/L。

有益效果：与现有技术相比，本发明的采用定芽增殖的方法，可避开传统的翅果油树组织培养方法中愈伤及不定芽诱导过程中易出现褐化的难题；带有腋芽或定芽的茎段接种于包含0.006～0.008mg/LTDZ和0.1mg/LNAA的芽启动培养培养基上，处理7～10d，能有效促进叶腋处腋芽萌发，缩短育苗周期；芽伸长培养基的BA0.5mg/L和NAA0.05～0.07mg/L的激素配比，可有效促进定芽伸长为具有一定高度、粗度和木质化程度的嫩枝，有利于生根。

附图说明

图1是芽启动培养实物图；

图2是芽伸长培养结果图；

图3是生根图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

以下实施例使用的培养条件为：光照强度(2000lx)，光照时间14h/d，培养温度25℃左右；培养基pH5.7～5.8。

实施例1

一种翅果油树定芽增殖与植株再生方法，包括以下步骤：

(1)无菌苗的获得：选取发育良好的成熟翅果油树果实，物理机械法剥去外层坚硬果壳，以少量洗洁精和84消毒液浸泡10min并流水冲洗1h后，于超净台中用70％酒精浸泡40s，再以适量0.1％氯化汞并少量Tween～20，振荡浸泡20min，无菌水冲洗4～5次；然后在解剖镜下去除果实内层种皮，置于3/4MS培养基，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，获得腋芽饱满，健壮的实生苗。

(2)芽启动培养基的选择：将获得的实生苗，剪成带2～4个腋芽或顶芽长约3～4cm的茎段，如图1所示，水平接种于3/4MS基本培养基，附加的激素浓度配比为0.004、0.006、0.008、0.01、0.02、0.05、0.1mg/LTDZ和0.1mg/L NAA，处理时长5d、10d、15d。

(3)芽伸长培养基的选择：将上述芽启动培养基中处理5d、10d、15d的茎段接种于3/4MS基本培养基，附加的激素浓度配比为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/L BA和0.03、0.05、0.07、0.09mg/L NAA，20d继代一次。

芽启动培养过程中，TDZ浓度愈大，处理时间愈长，茎段膨大畸形程度及玻璃化程度愈严重，转至芽伸长培养基中进行芽伸长培养也相应的愈加困难。TDZ>0.01mg/L，处理时间>10d时，茎段过于膨大畸形，玻璃化严重；当0.004<TDZ<0.08mg/L，处理时间5～10d时，茎段出现一定程度的膨大，原本无腋芽的叶腋处萌发新芽，转至附加0.5mg/L BA，0.05～0.07mg/LNAA的芽伸长培养基，每茎段平均定芽数增至4～8个，如图2所示。

综合考虑外植体玻璃化程度、芽增殖率、芽伸长难易、培养周期长短等因素，芽启动培养基以TDZ浓度为0.006～0.008mg/L，处理时长7～10d为宜；芽伸长培养基以BA浓度为0.5mg/L，NAA浓度为0.05～0.07mg/L最佳，35d左右时，芽苗高度约4～6cm。

(4)生根培养：待芽伸长至具有一定粗度、高度(约6cm以上)及木质化程度后，接种于1/2MS基本培养基，附加IBA、NAA、KT和25g/L蔗糖，35d时统计数据。生根率＝生根成功的苗数/接种的苗数；生根条数＝根的总条数/生根成功的苗数。

生根培养基和激素使用情况及相应的结果如表1和图3所示。生长素浓度极大的影响翅果油树组培苗的长势和根的诱导效率。生长素浓度较低(IBA<1.0mg/L，NAA<0.03mg/L)时，不生根或生根慢，根数量少；生长素浓度较高(IBA>1.5mg/L，NAA>0.03mg/L)时，苗基部易形成愈伤，落叶严重，导致生根失败。

表1生根培养基和激素使用及相应的实验结果

综合考虑外植体生根率、根的质量、苗的长势，适合生根的培养基为IBA1.5mg/L，IAA0.03mg/L，附加或不附加0.01mg/L KT，生根率达30.0％～36.7％。