芹菜根系分泌物浓缩液对番茄青枯病菌的抑制及其提取方法与流程

本发明涉及蔬菜抗病栽培技术领域，尤其是涉及一种芹菜根系分泌物浓缩液对番茄青枯病菌的抑制及其提取方法。

背景技术：

番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)起源于南美洲墨西哥，品种多、适应范围广、产量高、营养丰富、用途广泛，是世界上重要的食用蔬菜作物之一；在我国，限制番茄生产发展的最主要因素之一就是病害的流行危害，农作物青枯病是一种世界性的细菌性病害，其对番茄的为害尤为严重；番茄青枯病在我国长江以南，尤其是华南地区发生日益严重，造成番茄种植的减产甚至绝收；随着我国设施栽培番茄规模的迅速扩大，番茄青枯病菌(Pseudomonas solanacearum)的防治难度进一步加大，严重制约了我国南方地区番茄种植产业的健康发展。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有番茄种植产业中病害发生严重，尤其是青枯病高发的问题，提供了一种使用方便、成本低廉、能够显著抑制番茄连坐土壤中青枯病菌生物活性的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：芹菜根系分泌物浓缩液，所述的芹菜根系分泌物浓缩液用于抑制番茄青枯病菌。

芹菜根系分泌物浓缩液的提取方法，包括如下步骤：1)芹菜采用营养钵培植，每钵均匀撒播种子20粒，人工气候室内培养，采用12小时人工光照，昼夜温度25℃/20℃；2)45天后，将培养芹菜从营养钵中小心取出，充分冲洗去除根上附着土壤，取长势健壮芹菜5株，将芹菜根系部分放入避光三角烧瓶，采用1/2Hoagland营养液水培；3)水培3天后至芹菜根系生长旺盛，将芹菜根系部分转入含有200ml无菌水的避光三角烧瓶中培养；4)培养2天后，迅速过滤搜集三角烧瓶中培养液，并在-50℃条件下冷冻蒸发，浓缩至原体积的1/20，即为芹菜根系分泌物的浓缩液；5)将芹菜根系分泌物的浓缩液经过0.22μm滤头过滤后，在4℃下无菌保存。

作为优选，所述的步骤1中芹菜品种为津南实芹一号，所述步骤1的营养钵中采用如下成分及比例，草炭：蛭石＝3:1。

作为优选，所述的步骤2中从营养钵中取出的芹菜高度为30-40cm。

番茄青枯病菌的制备方法，包括，1)采用的番茄青枯病菌为高致病性青枯病菌种Pseudomonas solanacearum；2)高致病性青枯病菌种的扩繁培养基为523培养基，其组分及含量如下：七水合硫酸镁0.3克、磷酸氢二钾2.0克、酵母提取物4.0克、酪蛋白水解物8.0克、蔗糖10.0克、琼脂15.0克；3)上述组分混合后加入蒸馏水，形成1升溶液制剂，该溶液制剂进行121℃下，15分钟的高温高压灭菌后，在4℃下无菌保存；4)在523培养基上接种Pseudomonas solanacearum，28℃培养2天扩繁。

本方案中，所得芹菜根系分泌物浓缩液抑制番茄青枯病菌生长的鉴定方法，包括如下步骤：1)从523培养基刮取扩繁的Pseudomonas solanacearum(race1)菌体，无菌水溶解稀释到OD₆₀₀＝0.1；2)配置分别含有芹菜根系分泌物浓缩液0μl,400μl,800μl,1600μl的523固体培养基(20ml/培养皿)和分别含有芹菜根系分泌物浓缩液0μl,400μl,800μl,1600μl的液体培养基(50ml/管)；3)在步骤2中的4种含有不同浓度芹菜根系分泌物的固体和液体培养基中分别接种OD₆₀₀＝0.1的Pseudomonas solanacearum(race1)菌液2μl；4)对固体培养基上的青枯病菌，利用标尺分别测量48h、72h和96h的菌斑直径；对液体培养基上的青枯病菌，利用紫外分光光度计分别测定36h、48h和60h的菌液浓度(OD₆₀₀)。

本方案提出了芹菜根系分泌物浓缩液对番茄青枯病菌Pseudomonas solanacearum(race1)的显著抑制作用，如图1所示，在523固体培养基上，不同浓度的芹菜根系分泌物对Pseudomonas solanacearum(race1)均有抑制作用，芹菜根系分泌物浓度越高，抑制作用越明显，图2为图1的数据体现，如表1所示，在523液体培养液中，不同浓度的芹菜根系分泌物对Pseudomonas solanacearum(race1)均有抑制作用，芹菜根系分泌物浓度越高，抑制作用越明显。

表1 523液体培养基中不同浓度芹菜根系分泌物浓缩液对青枯病菌的抑制

本方案的制剂中芹菜根系分泌物浓缩液和番茄青枯病菌Pseudomonas solanacearum(race1)外，其它均为辅助成分，其中，七水合硫酸镁(化学式：MgSO4.7H2O)、磷酸氢二钾(化学式：KH2PO4)和蔗糖(英文名sucrose)可用于配置培养基；酵母提取物，又称酵母味素，英文名称为Yeast extract，主要成分为多肽、氨基酸、呈味核苷酸、B族维生素及微量元素，是最为理想的生物培养基原料和发酵工业中的主要原料，可以大大提高菌种的生产速率及发酵产品得率；酪蛋白水解物，英文名为Casamino Acid，是一种蛋白分解多肽，为细菌生长提高营养；琼脂(英文名Agar)能够帮助液体培养基有效凝固；OD₆₀₀指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值，它的一个重要应用，就是利用细菌的吸光来测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况，所以通常用来指菌体细胞密度。

因此，本发明具有如下有益效果：1)使用方便；2)成本低廉；3)能够显著抑制番茄连坐土壤中番茄青枯病菌生物活性

附图说明

图1为本发明含有不同体积芹菜根系分泌物的523培养基上青枯病菌长势。

图2为图1的数据体现图。

图3为本发明实施例1的对照图。

图4为本发明实施例2的对照图。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的描述。

实施例1，芹菜根系分泌物对番茄青枯病菌的抑制作用，实施方法如下：

在人工气候室(12h光照/12h黑暗，昼夜温度25℃/20℃)中种植芹菜‘津南实芹一号’，每盆撒播芹菜种子20粒，当芹菜长至30-40cm高时，连根拔出，收集盆中剩余基质待用，此外，在人工气候室穴盘中种植番茄野生型株系‘Alisa’，待番茄植株长至5叶1心时，3株移栽至正常基质中(对照)，4株移栽至种植过芹菜的基质中(处理)，同时在处理和对照的基质中加入番茄青枯病菌Pseudomonas solanacearum(race1)100ml(OD600＝1.0)，高湿环境下观察；结果表明4天后，对照组中3株番茄均发生青枯病症状，而处理组中的番茄生长正常，说明芹菜根系分泌物有效抑制了基质中青枯病菌的活性，从而延缓甚至阻止了番茄植株的发病，见图3所示。

实施例2，芹菜根系分泌物浓缩液对番茄青枯病菌的抑制作用，实施方法如下：

在人工气候室(12h光照/12h黑暗，昼夜温度25℃/20℃)中种植芹菜‘津南实芹一号’，每盆撒播芹菜种子20粒。当芹菜长至30-40cm高时，连根从盆中小心拔出，充分冲洗去除根上附着土壤，避免伤根；取长势健壮芹菜5株，根系部分放入避光三角烧瓶，采用1/2Hoagland营养液水培3天后(使芹菜根系生长旺盛)，转入含有200ml无菌水的避光三角烧瓶中培养并收集根系分泌物的浓缩液待用；此外，在人工气候室穴盘中种植番茄野生型株系‘Alisa’，待番茄植株长至5叶1心时，3株移栽至正常基质中(对照)，3株移栽至拌有芹菜根系分泌物浓缩液100ml的基质中(处理)，同时在处理和对照的基质中加入番茄青枯病菌Pseudomonas solanacearum(race1)100ml(OD600＝1.0)，高湿环境下观察；结果表明4天后，对照组中3株番茄均发生青枯病症状，而处理组中的番茄生长正常，说明芹菜根系分泌物有效抑制了基质中青枯病菌的活性，从而延缓甚至阻止了番茄植株的发病，如图4所示。