一种同源精子诱导中华鲟雌核发育的方法与流程

文档序号:11071489阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种同源精子诱导中华鲟雌核发育的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:

(1)中华鲟精子遗传物质的灭活:

采集中华鲟精子,选取活力在80%以上的中华鲟精子与精子稀释液混合,于0-2℃预冷的培养皿中,进行紫外线灭活;

(2)中华鲟卵子采集及与中华鲟灭活精子授精:

选择成熟的中华鲟雌鱼,水温18-19.5℃,人工注射LHRH-A2催产,在效应时间来临时采用腹部挤压的方法采集卵子,用所述步骤(1)灭活后精子进行授精,精子洒在卵上进行卵受精,加入养殖用水摇匀,再加水洗涤,放入含有滑石粉养殖用水的脱粘瓶中进行充气脱粘处理;

(3)热休克加倍处理:

在步骤(2)脱粘处理一段时间后,进行热休克处理;

(4)雌核发育卵的培育:

步骤(3)结束后的卵继续脱粘,脱粘结束后放入喷淋式孵化筛进行孵化培育;

(5)雌核苗的分子鉴定:

利用微卫星DNA标记筛选的方法,筛选使用灭活精子的亲鱼特异等位基因的微卫星位点,不少于两对;

完成同源精子诱导中华鲟雌核的发育。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(1)精子紫外遗传灭活是在0-2℃低温环境下操作,经稀释后的中华鲟精液放置于在冰上预冷培养皿中,厚度≤1mm。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述精子稀释有两种方式,

一种方式是利用中华鲟精液经过3000-5000g离心力离心3-5分钟的上清液作为精子稀释液进行中华鲟精子稀释,中华鲟精子与上清液的体积比为1:2-1:5;

另一种方式是配置与中华鲟精子等渗透压的稀释液进行稀释,中华鲟精子与等渗透压稀释液的体积比为1:2~1:4,所述等渗透压的稀释液为:蔗糖20-100 mmol/L,20mmol/L Tris-HCl,KCl 1-2 mmol/L,pH 8.5。

4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(1)紫外线灭活方法为将培养皿置于铺有碎冰的摇床上,震荡频率为60-90 rpm,在无菌操作台的紫外灯照射度为335.6 μw/cm2,照射时间7-8分钟时间。

5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(2)授精方法为以1mL配比500-1000粒卵的比例,洒在卵上,之后加入1倍卵子体积的养殖用水摇匀1分钟,之后再加一倍的水洗涤,之后放入18-19.5℃含有10%-15%的滑石粉的养殖用水悬浊液的脱粘瓶中进行充气脱粘处理。

6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(3)热休克加倍处理方法为,受精卵在水温18℃脱粘处理17.5-18.9分钟后进行热休克处理,处理的温度范围在35-38℃,持续时间为2min。

7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(4)放入喷淋式孵化筛进行培育,孵化水温为18-19.5℃。

8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述方法中步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)总时间为50-70分钟。

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