本发明属于稳定同位素分析技术领域，具体涉及一种用于碳稳定同位素检测植物样品的前处理方法及应用。
背景技术：
在梨的矮化密植栽培中，梨的矮化砧及砧穗组合(砧木与品种组合)的综合栽培性状是一项重要的研究内容，其中，水分利用率和生物节水性又是一项重要的生理指标。目前在梨的栽培生理研究中，使用最为广泛的是采用便携式光合系统进行瞬时水分利用率测定，但是其测定结果不能反映梨的生长周期中长期水分利用率(WUE)的整体情况，而且筛选周期较长，结果的准确性也不够好，对于梨属矮化砧的筛选和鉴定影响较大。
由于梨属砧木之间的碳稳定同位素代谢存在着差异，尤其梨属矮化砧木和乔化砧木之间差异较大，因此碳稳定同位素法检测梨属砧木的水分利用率和生物节水性逐渐被广泛使用。
目前在碳稳定同位素对植物长期水分利用率的检测中，植物样品的前处理多沿用聚乙二醇溶液胁迫处理方法。但聚乙二醇溶液胁迫处理更适用于植物苗期和短期的胁迫处理，不适用于长时间的水分胁迫处理，尤其是不利于多年生梨树的长期水分利用率检测。
技术实现要素：
本发明提供的一种用于碳稳定同位素检测的植物样品的前处理方法，解决了现有植物样品前处理方法中，聚乙二醇溶液胁迫处理不适合多年生植物的长时间水分胁迫处理的问题。
本发明的目的是提供一种用于碳稳定同位素检测的植物样品的前处理方法，包括以下步骤：
步骤1，分别将珍珠岩和石英砂晾晒、自然风干，然后将珍珠岩和石英砂按1:1-9的体积比例混合，得到珍珠岩-石英砂混合物，然后置于容器中，加入营养液浸泡12-24h，然后沥掉多余水分，得到珍珠岩-石英砂基质；
步骤2，根据待检测植物苗木的大小，选择栽培容器，将珍珠岩-石英砂基质装入容器内，并将待检测植物苗木栽植于栽培容器内；
步骤3，常规栽培管理缓苗培养；
步骤4，进行水分胁迫培养，包括：测定珍珠岩-石英砂混合物的最大持水量；向栽培容器内交替补充水分和营养液，使栽培容器内珍珠岩-石英砂基质的含水量为最大持水量的30-100％；常规栽培管理，直至得到生长期的植物；
步骤5，取生长期植物的健康完整叶片，洗净，除去表面多余水分，然后于105℃杀青15分钟，之后于65℃恒温烘干至恒重，得到烘干的叶片；
步骤6，取烘干的叶片研磨成细粉，过100目筛，得到用于碳稳定同位素检测的样品；
其中，所述营养液按以下浓度的组分配制而成：0.6-0.65g/L的KNO3、0.9-0.95g/L的Ca(NO3)2、0.20-0.25g/L的NH4H2PO4、0.10-0.15g/L的MgSO4、3.6-3.8mg/L的KCl、0.6-0.62mg/L的H3BO3、0.29-0.31mg/L的MnSO4、0.31-0.33mg/L的ZnSO4、0.11-0.13mg/L的CuSO4、0.079-0.081mg/L的(NH4)6Mo7O24、18.6-18.8mg/L的Fe-EDTA，溶剂为水。
优选的，步骤1中，珍珠岩和石英砂的体积比例为1:2。
优选的，步骤1中，营养液浸泡的时间为12h。
优选的，步骤4中，向栽培容器内交替补充水分和营养液，使栽培容器内珍珠岩-石英砂基质的含水量为最大持水量的40-50％。
优选的，步骤4中，向栽培容器内交替补充水分和营养液，使栽培容器内珍珠岩-石英砂基质的含水量为最大持水量的70-80％。
优选的，所述营养液按以下浓度的组分配制而成：0.6g/L的KNO3、0.9g/L的Ca(NO3)2、0.23g/L的NH4H2PO4、0.12g/L的MgSO4、3.7mg/L的KCl、0.6mg/L的H3BO3、0.3mg/L的MnSO4、0.32mg/L的ZnSO4、0.13mg/L的CuSO4、0.08mg/L的(NH4)6Mo7O24、18.8mg/L的Fe-EDTA，溶剂为水。
本发明还提供了一种上述用于碳稳定同位素检测的植物样品的前处理方法，在梨属砧木的水分利用率研究中的样品预处理的应用。
优选的，上述应用中，所述栽培容器采用圆柱状的塑料盆，且该塑料盆的高30cm，外直径为27cm，内直径为23cm。
优选的，上述应用中，步骤4中取生长期梨属砧木的枝条顶端向下第7-10个叶片。
本发明提供的一种用于碳稳定同位素检测的植物样品的前处理方法，将营养液水培和盆栽控水胁迫处理有机的结合在一起，应用于碳稳定同位素的检测，与营养土盆栽控水方法相比，试验的均一性更好，试验中的影响因子较为单一，试验干扰因素容易排除，可控性更好，能够达到更为理想的控水效果，检测数据和结果更为准确可靠。可以准确而较快的得到多年生梨属矮化砧和砧穗组合整个生长季或某生长阶段的长期水分利用率数据和结果，用于梨属矮化砧和砧穗组合的长期水分利用率和综合栽培性状的筛选鉴定，提高试验研究的效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。
本发明一种用于碳稳定同位素检测的植物样品的前处理方法，包括以下步骤：
步骤1，分别将珍珠岩和石英砂晾晒、自然风干，然后将珍珠岩和石英砂按1:1-9的体积比例混合，得到珍珠岩-石英砂混合物，然后置于容器中，加入营养液浸泡12-24h，然后沥掉多余水分，得到珍珠岩-石英砂基质；
其中，所述营养液按以下浓度的组分配制而成：0.6-0.65g/L的KNO3、0.9-0.95g/L的Ca(NO3)2、0.20-0.25g/L的NH4H2PO4、0.10-0.15g/L的MgSO4、3.6-3.8mg/L的KCl、0.6-0.62mg/L的H3BO3、0.29-0.31mg/L的MnSO4、0.31-0.33mg/L的ZnSO4、0.11-0.13mg/L的CuSO4、0.079-0.081mg/L的(NH4)6Mo7O24、18.6-18.8mg/L的Fe-EDTA，溶剂为水。
步骤2，根据待检测植物苗木的大小，选择栽培容器，将珍珠岩-石英砂基质装入容器内，并将待检测植物苗木栽植于栽培容器内；
步骤3，常规栽培管理缓苗培养；
需要说明的是，该缓苗培养之后，可以根据具体试验要求确定开始进行下一步试验操作。
步骤4，进行水分胁迫培养，包括：测定珍珠岩-石英砂混合物的最大持水量；向栽培容器内交替补充水分和营养液(维持珍珠岩-石英砂基质含水量的时候，水分-营养液可交替补充)，使栽培容器内珍珠岩-石英砂基质的含水量为最大持水量的30-100％；常规栽培管理，直至得到生长期的植物。
需要说明的而是，分别将珍珠岩和石英砂晾晒、自然风干后的含水量可忽略不计；珍珠岩-石英砂混合物的最大持水量是用水将珍珠岩-石英砂混合物浸泡，使其充分吸水饱和，然后沥掉多余的水分，得到水分饱和混合物，测定水分饱和混合物的质量(W1)，同时测定珍珠岩-石英砂混合物浸水前的质量(W2)，根据公式(W1-W2)/W2计算得到该珍珠岩-石英砂混合物的最大持水量。
需要说明的是，所述生长期的植物是本领域人员常规认知的植物叶片数量充足、达到试验要求，长势基本一致的植物。
步骤5，取生长期植物的健康完整叶片，洗净，除去表面多余水分，然后于105℃杀青15分钟，之后于65℃恒温烘干至恒重，得到烘干的叶片。
需要说明的是，应当所取的生长期植物的健康完整叶片样品，置于1-4℃保存备用。
需要说明的是，将除去表面多余水分后的叶片置于电热恒温干燥箱中105℃杀青15分钟，之后于65℃恒温烘干至恒重。
步骤6，取烘干的叶片研磨成细粉，过100目筛，得到用于碳稳定同位素检测的样品。
下面以梨属砧木为例，说明本发明样品前处理的方法。
实施例1
一种用于碳稳定同位素检测的植物样品的前处理方法，具体包括以下步骤：
步骤1，分别将珍珠岩和石英砂晾晒、自然风干，然后将珍珠岩和石英砂按1:2的体积比例混合，得到珍珠岩-石英砂混合物，然后置于容器中，加入营养液浸泡12h，然后沥掉多余水分，得到珍珠岩-石英砂基质。
其中，所述营养液中含有以下组分：0.6g/L的KNO3、0.9g/L的Ca(NO3)2、0.23g/L的NH4H2PO4、0.12g/L的MgSO4、3.7mg/L的KCl、0.6mg/L的H3BO3、0.3mg/L的MnSO4、0.32mg/L的ZnSO4、0.13mg/L的CuSO4、0.08mg/L的(NH4)6Mo7O24、18.8mg/L的Fe-EDTA，溶剂为水。
步骤2，根据待检测植物苗木的大小，选择栽培容器，将珍珠岩-石英砂基质装入容器内，并将待检测植物苗木栽植于栽培容器内。
步骤3，常规栽培管理缓苗培养7天。
步骤4，进行水分胁迫培养，包括：测定珍珠岩-石英砂混合物的最大持水量，向栽培容器内交替补充水分和营养液，使栽培容器内珍珠岩-石英砂基质的含水量为最大持水量70-80％，常规栽培管理90天，直至得到生长期的植物。
步骤5，取生长期植物的健康完整叶片，洗净，用干净纱布吸净叶片表面多余水分，然后于105℃杀青15分钟，之后于65℃恒温烘干至恒重，得到烘干的叶片。
步骤6，取烘干的叶片研磨成细粉，过100目筛，得到用于碳稳定同位素检测的样品。
实施例2
一种用于碳稳定同位素检测的植物样品的前处理方法，具体包括以下步骤：
步骤1，分别将珍珠岩和石英砂晾晒、自然风干，然后将珍珠岩和石英砂按1:9的体积比例混合，得到珍珠岩-石英砂混合物，然后置于容器中，加入营养液浸泡24h，然后沥掉多余水分，得到珍珠岩-石英砂基质。
其中，所述营养液中含有以下组分：0.65g/L的KNO3、0.95g/L的Ca(NO3)2、0.20g/L的NH4H2PO4、0.10g/L的MgSO4、3.6mg/L的KCl、0.62mg/L的H3BO3、0.29mg/L的MnSO4、0.31mg/L的ZnSO4、0.11mg/L的CuSO4、0.079mg/L的(NH4)6Mo7O24、18.6mg/L的Fe-EDTA，溶剂为水。
步骤2，根据待检测植物苗木的大小，选择栽培容器，将珍珠岩-石英砂基质装入容器内，并将待检测植物苗木栽植于栽培容器内。
步骤3，常规栽培管理缓苗培养10天。
步骤4，进行水分胁迫培养，包括：测定珍珠岩-石英砂混合物的最大持水量，向栽培容器内交替补充水分和营养液，使栽培容器内珍珠岩-石英砂基质的含水量为最大持水量70-80％，常规栽培管理80天，直至得到生长期的植物。
步骤5，取生长期植物的健康完整叶片，洗净，用干净纱布吸净叶片表面多余水分，然后于105℃杀青15分钟，之后于65℃恒温烘干至恒重，得到烘干的叶片。
步骤6，取烘干的叶片研磨成细粉，过100目筛，得到用于碳稳定同位素检测的样品。
实施例3
一种用于碳稳定同位素检测的植物样品的前处理方法，具体包括以下步骤：
步骤1，分别将珍珠岩和石英砂晾晒、自然风干，然后将珍珠岩和石英砂按1:1的体积比例混合，得到珍珠岩-石英砂混合物，然后置于容器中，加入营养液浸泡18h，然后沥干，得到珍珠岩-石英砂基质。
其中，所述营养液中含有以下组分：0.63g/L的KNO3、0.93g/L的Ca(NO3)2、0.25g/L的NH4H2PO4、0.15g/L的MgSO4、3.8mg/L的KCl、0.6mg/L的H3BO3、0.29mg/L的MnSO4、0.33mg/L的ZnSO4、0.11mg/L的CuSO4、0.08mg/L的(NH4)6Mo7O24、18.7mg/L的Fe-EDTA，溶剂为水。
步骤2，根据待检测植物苗木的大小，选择栽培容器，将珍珠岩-石英砂基质装入容器内，并将待检测植物苗木栽植于栽培容器内。
步骤3，常规栽培管理缓苗培养14天。
步骤4，进行水分胁迫培养，包括：测定珍珠岩-石英砂混合物的最大持水量，向栽培容器内交替补充水分和营养液，使栽培容器内珍珠岩-石英砂基质的含水量为最大持水量40-50％，常规栽培管理60天，直至得到生长期的植物。
步骤5，取生长期植物的健康完整叶片，洗净，用干净纱布吸净叶片表面多余水分，然后于105℃杀青15分钟，之后于65℃恒温烘干至恒重，得到烘干的叶片。
步骤6，取烘干的叶片研磨成细粉，过100目筛，得到用于碳稳定同位素检测的样品。
取10个不同的梨属砧木样品，试材编号依次为1-10，重复3次，分别利用实施例1-3的方法进行前处理，以及利用传统的聚乙二醇胁迫处理方法进行前处理，然后测定梨属砧木的碳稳定判断值△13C(‰)，结果如表1所示。由表1可知，实施例1、实施例2、实施例3中，各处理的梨属砧木样品长势比较一致，水分处理间表现有差异，并且测得的碳稳定判断值△13C表现出较好的稳定性。
而利用传统的聚乙二醇胁迫处理方法进行前处理后，植株栽培出现生长状况不佳，因此无法准确的测量碳稳定判断值△13C(表1中并未给出相关数据)，且植株栽培过程中，聚乙二醇的浓度难以控制到位。
需要说明的是，表1的数据仅是为了证明本发明前处理方法的可行性，所以实施例1-3采用的营养液配方等参数稍有不同。但是具体测定水分胁迫处理对植物△13C的影响时，应当以水分作为单一变量，而保证不同样品之间的营养液配方等其他参数一致。
表1碳稳定判断值△13C(‰)
此外，由于传统的营养土盆栽控制水分的方法，与营养液相比，试验影响因子较多，试验的均一性较差，试验中的差异因子不容易排除。
本发明的方法将营养液水培和盆栽控水胁迫处理有机的结合在一起，应用于碳稳定同位素的检测，与营养土盆栽控水方法相比，试验的均一性更好，试验中的影响因子较为单一，试验干扰因素容易排除，可控性更好，能够达到更为理想的控水效果，检测数据和结果更为准确可靠。
本发明的方法适用于植物生长30-90d的碳稳定判断值△13C，可以准确而较快的得到植物的长期水分利用率数据和结果，尤其是可以比较准确而较快的得到多年生梨属矮化砧和砧穗组合整个生长季或某生长阶段的长期水分利用率数据和结果，用于梨属矮化砧和砧穗组合的长期水分利用率和综合栽培性状的筛选鉴定，提高试验研究的效率。
本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。