一种脂肪组织冻存液的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种脂肪组织冻存液。

背景技术：

脂肪组织主要由大量群集的脂肪细胞构成，聚集成团的脂肪细胞由薄层疏松结缔组织分隔成小叶，脂肪组织中的网状纤维很发达。黄(白)色脂肪组织呈黄色(在某些哺乳动物呈白色)。脂肪组织由大量单泡脂肪细胞集聚而成，脂肪细胞呈圆形或多边形，细胞中央有一大脂滴，胞质呈薄层，位于细胞周缘，包绕脂滴。在切片上，脂滴被溶解成一大空泡；胞核扁圆形，被脂滴推挤到细胞一侧，连同部分胞质呈新月形。黄色脂肪组织主要分布在皮下组织、网膜和肠系膜等处，在成年男子一般约占体重的10％～20％，女人往往更多一些。脂肪组织是体内最大的“能源库”，具有贮存脂肪、保持体温和参与脂肪代谢的功能。脂肪组织还参与能量代谢，并具有产生热量、维持体温、缓冲保护和支持填充等作用。棕色脂肪组织呈棕色，其特点是组织中有丰富的毛细血管，脂肪细胞内散在许多小脂滴，线粒体大而丰富，核圆形，位于细胞中央，这种脂肪细胞也被称为多泡脂肪细胞。

自体脂肪是一种理想的填充材料，几乎可用于全身各个部位的软组织缺损填充。然而，脂肪移植最大的缺陷就是脂肪组织的坏死吸收，成活率不高。尽管为了提高成活率和减少吸收率，国内外的研究人员进行了大量的研究，但目前移植后脂肪组织体积最终只能保持在移植时的50％左右。因此，临床上仍需要通过少量、反复、多次移植提高脂肪移植成活率，以达到患者满意的填充效果。但多次脂肪注射除增加了医生的工作量外，也对患者造成多次抽脂的痛苦，还有承担较高的风险及高昂的费用。如果能实现一次抽取足够的脂肪体外长期冷冻储存，需要时复温培养后注射移植，则具有重要的临床应用价值。

技术实现要素：

有鉴于此，为了解决上述问题，本发明公开了一种能长时间冻存脂肪组织的冻存液。

本发明公开了一种脂肪组织冻存液，按体积浓度计，包括如下组分：

二甲基亚砜 10～20％；

含非必须氨基酸的基础培养基 65～90％；

右旋糖苷 1～20％；

所述冻存液还包括含量为0.5～1.5g/ml的海藻糖；

其中，所述基础培养基与非必须氨基酸的比例为100:1；

所有组分的体积浓度总和为100％。

作为优选，所述脂肪组织冻存液的最优配比，按体积浓度计，包括如下组分：

二甲基亚砜 20％；

含非必须氨基酸的基础培养基 70％；

右旋糖苷 5％；

所述冻存液还包括含量为1g/ml的海藻糖；

其中，所述基础培养基与非必须氨基酸的比例为100:1；

所有组分的体积浓度总和为100％。

作为优选，所述基础培养基为DMEM、DMEM/12或1640培养基。

作为优选，所述右旋糖酐为中分子右旋糖酐、低分子右旋糖酐和小分子右旋糖酐中的任意一种。其中，最优选为中分子右旋糖酐。

作为优选，所述海藻糖为α,α-型海藻糖、α,β-型海藻糖和β,β-型海藻糖中的任意一种。其中，最优选为α,α-型海藻糖。

本发明还公开了一种脂肪组织的冻存方法，包括以下步骤：

预处理过的脂肪组织放入含上述冻存液的冻存管内制成冻存样品，然后将所述冻存样品放入程序降温盒中，再将所述程序降温盒放入-80℃冰箱内，24h后将所述冻存样品转入液氮，完成冻存。

本发明还公开了所述脂肪组织冻存液在生物组织保藏中的应用。

对本发明公开的冻存液中包括的部分组分介绍如下：

二甲基亚砜(DMSO)，是一种含硫有机化合物，分子式为(CH₃)₂SO，常温下为无色无臭的透明液体，是一种具有吸湿性的可燃液体，具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被称为“万能溶剂”。在酸存在时对DMSO加热会产生少量甲基硫醇、甲醛、二甲基硫和甲磺酸等化合物。DMSO在高温下有分解现象，遇氢能发生剧烈反应，在空气中燃烧发出淡蓝色火焰。DMSO可用作有机溶剂、反应介质和有机合成中间体，也可用作合成纤维的染色溶剂、去染剂和染色载体，还可用作回收乙炔和二氧化硫的吸收剂。DMSO能快速通过细胞膜进入细胞内部，在细胞冷冻过程中，维持细胞内外的水和离子平衡。

非必需氨基酸(MEM NEAA)，包括丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸等。非必需氨基酸可通过人体自身合成或从其它氨基酸转化得到。有些非必需氨基酸的摄入量还会影响必需氨基酸的需求量，例如，当膳食中的半胱氨酸和酪氨酸充裕时，可分别减少对蛋氨酸和苯丙氨酸的需求。因此，半胱氨酸和酪氨酸又被称为半必需氨基酸或条件必需氨基酸。非必需氨基酸可在动物体内合成，作为营养源，不需要从外部补充氨基酸。对人来说非必需氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。这些氨基酸由碳水化合物的代谢物或由必需氨基酸合成碳链，进一步由氨基转移反应引入氨基生成氨基酸。已知即使摄取非必需氨基酸，也是对生长有利的。

右旋糖酐系蔗糖经肠膜状明串珠菌-1226(Leuconostoc mesenteroides)发酵合成的一种高分子葡萄糖聚合物，是目前最佳的血浆代用品之一。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品，用于治疗出血性休克、创伤性休克及烧伤性休克等。低、小分子右旋糖酐能改善微循环，预防或消除血管内红细胞聚集和血栓形成等，亦有扩充血容量的作用，用于治疗各种休克所致的微循环障碍、弥漫性血管内凝血、心绞痛、急性心肌梗塞及其他周围血管疾病等。

海藻糖又名茧蜜糖、蘑菇糖，是动物、植物、微生物中广泛分布的一种低聚糖。当生物处于逆境时，其含量增加，是一种典型的应激代谢产物。由于其具有抗逆、抗寒、抗旱、耐高温、吸水、保湿及保护细胞内的生物大分子等特点，使得它在食品、保健品、医药、化妆品、农业等方面有很大的应用前景。

在本发明中，右旋糖酐可以为组织块的冻存模拟一个接近原始的环境；当脂肪组织离开机体后缺乏营养供应，对氨基酸的补充需要完整，包括必需氨基酸和非必需氨基酸的补充，这样才能保证脂肪组织块的活性；DMSO能快速通过细胞膜进入细胞内部，在细胞冷冻过程中，维持细胞内外的水和离子平衡，同时可以时保护液中让各组分间的充分混合以及具有协同增效的作用。海藻糖具有生物保护的特点能进一步保护脂肪组织的活性。

用本发明实施例制备的脂肪组织冻存液对脂肪组织进行冻存，3个月后将冻存的脂肪组织复苏并分离得到脂肪干细胞的形态与冻存前进行原代分离得到的脂肪干细胞的形态一致，且相比于传统的冻存液，用本发明实施例制备的冻存液冻存复苏后的脂肪干细胞的存活率高，且细胞的免疫表型和分化能力没有发生变化。

综上所述，本发明公开了一种脂肪组织冻存液，该冻存液能为脂肪组织模拟一个接近原始的环境和提供充足的营养物质，对脂肪组织的冻存效果好，能对脂肪组织进行长时间的冻存。从冻存复苏后的脂肪组织分离得到的脂肪干细胞的细胞形态、免疫表型和分化能力与冻存前相比未发生变化。且该脂肪组织冻存液的成本低，利于大规模推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为正常原代分离的脂肪干细胞的显微镜图；

图2为本发明实施例制备的脂肪组织冻存液冻存复苏后原代分离得到的脂肪干细胞的显微镜图；

图3为为冻存复苏后进行分离得到的脂肪干细胞的流式结果图；

图4为未冻存直接进行原代分离得到的脂肪干细胞的流式结果图；

图5为脂肪干细胞体外向成骨细胞诱导分化的显微镜染色图。

具体实施方式

本发明公开了一种脂肪组织冻存液，该冻存液对脂肪组织具有良好的冻存效果。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明实施例中所使用到的制剂均为市售或自制制剂。

非必需氨基酸为购自GIBCO公司的100×溶液。

右旋糖酐和海藻糖均购自Sigma公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1配制脂肪组织冻存液

其中，DMEM/F12与非必须氨基酸的比例为100:1。

在无菌条件下，将上述量的组分混合，制得2×的冻存液。在实际使用时将2×冻存液稀释成1×使用。

实施例2配制脂肪组织冻存液

其中，DMEM与非必须氨基酸的比例为100:1。

在无菌条件下，将上述量的组分混合，制得2×的冻存液。在实际使用时将2×冻存液稀释成1×使用。

实施例3配制脂肪组织冻存液

其中，1640培养基与非必须氨基酸的比例为100:1。

在无菌条件下，将上述量的组分混合，制得2×的冻存液。在实际使用时将2×冻存液稀释成1×使用。

实施例4脂肪组织冻存试验

使用实施例1配制的冻存液作为试验组，使用传统的冻存液作为对照组。传统冻存液的配方为80单位的FBS加上20单位的DMSO。

采集脂肪组织20份(均经过志愿者授权同意，年龄20～30岁，无传染性疾病)，将采集到的脂肪组织平均分为两部分，一部分进行原代分离，得到的细胞培养至P2代进行冻存；一部分用下述方法清洗筛选得到脂肪组织，将得到的脂肪组织平均分为两部分，一部分用试验组的脂肪组织冻存液冻存，另一部分用对照组的冻存液冻存。

对脂肪组织的清洗筛选方法(预处理)：使用等体积的生理盐水清洗2遍后500g离心5min，弃上层油脂层和下层生理盐水层，用剪刀剪碎后过2mm筛网，得到的脂肪组织为最终冻存用的脂肪组织。

将上述预处理过的脂肪组织放入含1ml冻存液的冻存管内制成冻存样品，将制备好的冻存样品放入程序降温盒中，再将程序降温盒放入-80℃冰箱内，24h后将成品转入液氮中，完成冻存，切不可直接将成品放入液氮。

将正常原代分离的脂肪干细胞在倒置显微镜下进行观察，结果如图1所示，图1A为正常原代分离的P2代脂肪干细胞放大40倍的显微镜图，图1B为正常原代分离的P2代脂肪干细胞放大100倍的显微镜图。正常人脂肪干细胞贴壁生长，为形态相对均一的梭形细胞。

上述正常原代分离方法为I型胶原酶消化法：将预处理后的脂肪组织用终浓度为0.2％的I型胶原酶消化1h后，1500rpm离心5min，离心终止后用培养基重悬接种。

冻存3个月后取出冻存的脂肪组织块，采用跟之前一样的原代分离方法对脂肪干细胞进行分离，统计结果如下：

组别 得到P0细胞 成功率

试验组 20 100％

对照组 12 60％

对复苏后进行分离培养得到的P2代细胞的在倒置显微镜下进行观察，结果如图2所示，图2A为试验组冻存复苏后分离得到的P2代脂肪干细胞放大40倍的显微镜图，图2B为试验组冻存复苏后分离得到的P2代脂肪干细胞放大100倍的显微镜图。通过比较图1和图2可以看出，试验组冻存复苏后分离得到的脂肪干细胞与未经冻存直接原代分离得到的脂肪干细胞形态一致，且试验组冻存复苏后分离得到脂肪干细胞的成功率要高于对照组，可见试验组的冻存液对脂肪组织的冻存效果要优于对照组。

用实施例2或3制备的冻存液重复上述试验，得到相似的结果。

实施例5冻存复苏后进行分离得到的细胞的免疫表型分析

试验组：将实施例4试验组(实施例1配制的冻存液)冻存3个月复苏后进行分离得到的脂肪干细胞培养至第3代，对细胞进行消化后清洗3次，制成细胞悬液，加入抗体后用流式细胞仪检测分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表达情况。

对照组：未经冻存的脂肪组织块直接进行原代分离得到脂肪干细胞，与试验组进行同样的流式分析。

将试验组和对照组的流式分析结果进行比较，试验组的流式结果见图3及表1：

表1试验组流式结果

对照组的流式结果见图4及表2：

表2对照组流式结果

流式细胞学检测显示，试验组和对照组的细胞标记物表达情况一样，均不表达阴性细胞标记物(造血细胞标记CD34、CD45、CD11、HLA-DR和CD19)；而阳性细胞标记物均呈高表达(整合素和黏附分子CD90，以及常用的人间充质干细胞标记CD73和CD105)，且试验组和对照组对阴性细胞标记物和阳性细胞标记物的表达情况无异(P>0.05)。说明实施例1配制的冻存液冻存后的脂肪组织良好地保持了其原有的活性，获取的脂肪干细胞与新鲜脂肪组织无异。

取实施例2或3制备的冻存液重复上述试验，得到相似的结果。

实施例6冻存复苏后进行分离得到的细胞体外向骨细胞诱导分化检测

诱导试验组：将实施例4试验组(实施例1配制的冻存液)冻存6个月复苏后进行分离得到的脂肪干细胞培养至生长对数期P5代，接种于六孔板中，分别设置对照组与诱导组，每孔细胞接种密度均为1.0*10⁴/孔，每孔加2mlDMEM/F12完全培养基进行培养。待细胞融合到60-70％，弃去旧培养基，换成骨分化诱导培养基，每孔加液3ml，每3天换液一次；诱导培养到第4周时，用茜素红染色液对诱导组和对照组的细胞进行成骨染色鉴定并采集图像。

诱导对照组：未经冻存的组织块直接进行原代分离得到脂肪干细胞，与诱导试验组进行同样的体外向成骨细胞诱导分化的检测。

对照组：将实施例4试验组(实施例1配制的冻存液)冻存6个月复苏后进行分离得到的脂肪干细胞进行正常培养至生长对数期P5代，培养方法同诱导试验组。但在细胞融合到60～70％时，弃去旧培养基后，换成含5％FBS的低糖DMEM培养基，后续培养和染色方法同诱导试验组，不进行体外向成骨细胞的诱导分化。

结果如图5所示。

检测结果显示，诱导试验组和诱导对照组的脂肪干细胞均可以经诱导形成成骨细胞，茜素红染色发现诱导试验组的细胞浆中有大量的钙沉积，说明由实施例1制备的组织冻存液冻存后的脂肪组织块得到的细胞具有正常的分化能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。