本发明涉及蛋白质稳定同位素标记定量的
技术领域：
：，尤其是指一种用于昆虫蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法。
背景技术：
：：昆虫体内蛋白质定量分析为研究蛋白质功能和寻求疾病蛋白标记物和药物靶标带来了新的思维方式和研究方向。目前昆虫体内蛋白质定量技术主要有同位素代谢标记法的SILAC技术。SILAC(Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture，SILAC)是哺乳动物细胞稳定同位素代谢标记技术，其基本原理是采用含有轻、中或重型外源稳定同位素氨基酸(主要有Lys和Arg)加入培养基培养细胞，细胞在新合成的蛋白质中嵌合了同位素氨基酸，经过培养5-6代后(26)，细胞的所有蛋白质基本98％以上的蛋白质被同位素标记。通过不同条件处理，取等量不同处理条件下蛋白质混合，之后经过SDS-PAGE分离和质谱分析，通过比较一级质谱图中同位素峰型的面积大小进行相对定量，同时二级谱图鉴定蛋白质。SILAC有明显的局限性，其情况如下：1、操作繁琐。SILAC定量流程包括：细胞培养→蛋白提取→免疫沉淀→电泳分离→酶切消化→质谱检测→定量检测，操作复杂，原代细胞培养标记效率低，不方便实施。2、试验成本高。SILAC试剂非常昂贵。3、试验周期长。由于SILAC需要在进行培养的过程中添加标记，所以需要比较长的时间才能比较彻底地标记。虽然整个实验的时间主要取决于细胞生长的速率和所采用的各种样品处理步骤，但一般来说，SILAC实验从开始到结束，包括数据分析，大约需要20到25天。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于昆虫蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，该方法可应用于昆虫的蛋白质定量分析，操作简便，试验成本低，应用广泛，利于人们高效、低成本对大量样品进行蛋白质组分析。为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：一种用于昆虫蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，首先，利用酵母将N15无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，再将酵母磨碎，释放菌体所含蛋白质，经提取纯化制成含N15的菌体蛋白粉末，利用含N15的菌体蛋白粉末取代常规的N14蛋白，用于培养多种昆虫，为昆虫蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记。昆虫的基本营养需求包括糖类、蛋白质、脂类、维生素、无机盐和水分等。在大多数昆虫的人工饲料中，麦胚、大豆粉和酵母粉是主要的蛋白质来源。麦胚与大豆粉中的氨基酸含量并不均衡，且大豆粉中的氨基酸纯度不高，不能满足昆虫在生长发育过程中的需求。而酵母粉含有完整的氨基酸群，纯度和利用率高，是一种优质的蛋白质源。除此之外，酵母粉能提供多种B族维生素，保障昆虫正常生长发育，维持多种代谢过程。因此，本发明中的只含N15蛋白质的酵母粉可以作为蛋白源和氮源，提供N15同位素标记，配合糖类，脂类和其它营养物质制成昆虫人工饲料，用于培养多种昆虫。本发明所提供的方案步骤如下：1)按照以下配方配制只含N15(不含N14)的无机培养基：在1升的蒸馏水中，包含以下按质量百分比计的组分：2)使用高压灭菌锅，将步骤1)中的培养基灭菌；3)待步骤2)中的培养基冷却至室温后，挑取单菌落酵母菌接种在培养基中进行培养；4)待酵母菌培养代数达到6代以上，取出培养基，室温中静置至酵母菌体完全沉底，倒出液体培养基并舍弃，得到酵母菌体；5)用已灭菌的生理盐水或缓冲液洗涤酵母菌体，并使用布氏漏斗抽滤；6)收集到的菌体称重后，与缓冲液以1:1～1.5的比例混合成新的菌液，缓慢加入到液氮中，使得菌液进入液氮中形成小颗粒，将菌体液氮颗粒加入高速破碎机中破碎，得到粉末状的菌体；7)将菌体粉末倒出，用水浴融化后，再次注入到液氮中，重复步骤6)；8)将步骤7)中的菌体粉末融化后，放入高速离心机中离心，离心后，上清液含有酵母菌蛋白质，收集上清液，舍弃沉淀；9)含有蛋白质的液体装入透析袋中，使用流动水透析，洗脱其中的无机盐；10)透析后的液体先预冻，凝结成固体后，再放入冷冻干燥机中干燥，得到菌体蛋白粉末；11)N15昆虫饲料的配制：将步骤10)中制成的菌体蛋白粉末作为饲料的基本蛋白源，取代常规的N14蛋白用于培养，再加入不含N元素的糖类和其它无机盐物质，制成最终的N15昆虫饲料。在步骤2)中，酵母将培养基中的N15无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，而实际操作中可以根据最终配制的昆虫饲料选择不同的酵母菌和只含N15(不含N14)的无机培养基配方。在步骤11)中，可以依据情况配制N15果蝇饲料、N15棉铃虫饲料、N15甜菜夜蛾饲料等昆虫饲料。最终制备的饲料中N元素全部来源于步骤4)至步骤10)中经提取纯化后菌体蛋白粉末的N15，利用N15蛋白粉末取代常规的N14蛋白用于培养昆虫，为昆虫蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记，而无机盐和饲料的具体制作条件要根据昆虫种类的生长特征而定。本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：1、操作简单。本发明中涉及的操作都相对简单且容易上手，操作者经简单培训便可完成整个流程。2、试验成本低。本发明所用试剂和材料大多是普通试剂和材料，成本低；本发明所使用的设备简单易得，无需专人操作，节省了高昂的设备费用及人工成本。3、应用广泛。本发明所提出的方案，适用于多种昆虫的饲养与研究。具体实施方式下面结合多个具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1(N15果蝇饲料的制备)本实施例所述的用于昆虫蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，具体是N15稳定同位素标记果蝇饲料的制备方法，包括以下步骤：1)按照以下配方配制只含N15(不含N14)的无机培养基：在1升的蒸馏水中，包含以下按质量百分比计的组分：2)使用高压灭菌锅，将步骤1)中的培养基灭菌；3)待步骤2)中的培养基冷却至室温后，挑取单菌落酵母菌接种在培养基中进行培养；4)待酵母菌培养代数达到6代以上，取出培养基，室温中静置至酵母菌体完全沉底，倒出液体培养基并舍弃，得到酵母菌体；5)用已灭菌的生理盐水或缓冲液洗涤酵母菌体，并使用布氏漏斗抽滤；6)收集到的菌体称重后，与缓冲液以1:1～1.5的比例混合成新的菌液，缓慢加入到液氮中，使得菌液进入液氮中形成小颗粒，将菌体液氮颗粒加入高速破碎机中破碎，得到粉末状的菌体；7)将菌体粉末倒出，用水浴融化后，再次注入到液氮中，重复步骤6)；8)将步骤7)中的菌体粉末融化后，放入高速离心机中离心，离心后，上清液含有酵母菌蛋白质，收集上清液，舍弃沉淀；9)含有蛋白质的液体装入透析袋中，使用流动水透析，洗脱其中的无机盐；10)透析后的液体先预冻，凝结成固体后，再放入冷冻干燥机中干燥，得到菌体蛋白粉末；N15果蝇饲料的配制：说明：按照配方称量所需物品，先用2/3的水加热溶化琼脂，再加入糖或香蕉浆以及菌体蛋白粉；剩余1/3的水与玉米粉或米粉、麸皮混合，搅匀后缓缓倒入琼脂糖液中，边加热边搅拌，待煮沸数分钟后可停止加热。将流动的饲料倒入饲养器内，每一饲养器内的饲料厚度约为2cm即可，随后立即封口，直立静置。操作时应注意勿使饲料黏附在饲养器侧壁。待饲料凝结后，将饲养器内侧壁上的水珠及饲料擦干净，滴入丙酸并转动饲养器，使丙酸均匀分布于饲料表面即可。实施例2(N15棉铃虫饲料的制备)与实施例1不同的是本实施例制作培养N15棉铃虫饲料，按照以下配方配制只含N15的无机培养基：在1升的蒸馏水中，包含以下按质量百分比计的组分：其后按照与实施例1相同的工艺生产得到菌体蛋白粉末。N15棉铃虫饲料的配制：说明：按照配方称量淀粉和菌体蛋白粉，混合后用500～550ml水调匀，另将琼脂放入容器中，加入400～450ml水，加热至琼脂溶化，剩余的50ml水先放入高温灭菌锅中灭菌，待冷却后溶解抗坏血酸等成分。将溶化的琼脂倒入玉米淀粉和酵母粉混合调成的糊状物中，混合均匀，在高压灭菌锅中以120摄氏度灭菌15～20分钟，取出后立即加入防腐剂，并不断搅拌，待温度降为55～60℃左右时，加入胆固醇以及用无菌水溶解的抗坏血酸溶液，充分搅拌后，迅速倒入盛饲料的容器内，冷却至室温，然后贮藏于约4℃的冰箱中备用。实施例3(N15甜菜夜蛾饲料的制备)与实施例1不同的是本实施例制作培养N15甜菜夜蛾饲料，按照以下配方配制只含N15的无机培养基：在1升的蒸馏水中，包含以下按质量百分比计的组分：其后按照与实施例1相同的工艺生产得到菌体蛋白粉末。N15甜菜夜蛾饲料的配制：饲料成分用量(g)淀粉100～150菌体蛋白粉40～55维生素C4～6对羟基苯甲酸2～4山梨酸1.5～2.510％甲醛12～15(ml)琼脂14～18水950～1050(ml)说明：先将琼脂在水中煮沸溶化，然后加入用少量水拌湿的淀粉和菌体蛋白粉，搅拌均匀并再次煮沸。之后待温度下降到60～70℃时加入维生素和防腐剂，然后倒成约2cm的厚度置于瓷盘内冷却凝固，冷却后用保鲜膜覆盖放置4℃冰箱中待用。以上所述实施例只为本发明之较佳实施例，并非以此限制本发明的实施范围，故凡依本发明之形状、原理所作的变化，均应涵盖在本发明的保护范围内。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3