本发明涉及医学领域，具体的说是涉及一种软骨细胞冻存保护液及其应用和软骨细胞冻存方法。
背景技术：
：软骨细胞是在软骨发现的唯一一种细胞。软骨细胞主要作用是生成和维持软骨基质，关节软骨损伤后主要由软骨细胞增殖分化来修复。组织工程技术是最近20年新起的一门科学，在软骨缺损修复方面有很多成功的报道。其中软骨细胞的保存是组织工程技术中重要的环节，软骨细胞的增殖能力极有限，其冻存后的质与量直接影响修复作用。目前的软骨细胞冻存保护液，要么成分复杂，配制麻烦，要么冻存效果不理想。现在较为简单的冻存液配方主要有两类：1、dmso+血清；2、完全培养基+dmso+血清，而其他类型的冻存保护液多为在此两种配方的基础上添加其他保护细胞的物质，但是这些保护液的冻存效果并不满意。中国专利cn105850979a公开了一种骨髓间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法，其采用dmso+胎牛血清+骨髓间充质干细胞条件培养基组我诶冻存保护液进行保护，能够使骨髓间充质干细胞冻存复苏后细胞回收率和活力较高。然而，将该专利的冻存液应用于软骨细胞的冻存中发现，软骨细胞的回收率和存活率明显较差。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种软骨细胞冻存保护液，使得所述冻存保护液能够显著提高入骨细胞冻存复苏后的细胞回收率、细胞存活率和细胞增殖能力，同时基于该冻存保护液本发明提供了一种软骨细胞的冻存方法。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种软骨细胞冻存保护液，包括dmso、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子；做为优选，所述冻存保护液由dmso、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子；所述脐带间充质干细胞生长因子为脐带间充质干细胞经1640培养基培养后的培养基上清液冻干粉。针对现有软骨细胞冻存保护液保护效果不理想的问题，本发明将dmso、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子作为保护液的有效成分，通过各组分的共同作用，实现了软骨细胞冻存复苏后细胞活率和回收率保持在较高水平的目的，同时提高了细胞增殖能力。作为优选，所述冻存保护液中dmso和胎牛血清的体积比为(1-2):(8-9)；在具体实施方式中，所述冻存保护液中dmso和胎牛血清的体积比为1:9或1:4，两者上述配比均可以转换成任何形式，只要符合比例即可。作为优选，所述冻存保护液中脐带间充质干细胞生长因子的浓度为1-2mg/ml。本发明在具体实施方式中还提供了所述脐带间充质干细胞生长因子由具体制备方法，如下：取p1-p5代的脐带间充质干细胞扩繁，用低糖dmem+10％fbs培养细胞，3天一换液，至细胞生长融合度达80％以上时，换用1640培养基培养，每天收集培养细胞的培养基，连续收集三天，通过滤膜过滤浓缩同时除去颗粒物质，滤液浓缩至蛋白质浓度为1000mg/l时冻干，获得生长因子。更为具体地，取p1-p5代的脐带间充质干细胞，用低糖dmem+10％fbs进行大规模培养，接种于培养皿或培养瓶中，接种密度1-10×105cell/ml；3天一换液，当细胞生长融合度达80％以上时，以pbs清洗细胞两遍，换用1640培养基继续培养细胞，每天收集培养细胞的培养基，连续收集三天，先经0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质，滤液再经0.22μm滤膜过滤浓缩并除去3kda以下小颗粒物质，滤液浓缩至蛋白质浓度为1000mg/l时冻干，获得生长因子。以不同冻存保护液对相同来源的软骨细胞进行冻存试验，待复苏后统计各处理组软骨细胞的回收率和存活率，结果显示，本发明冻存保护液能够显著提高软骨细胞的回收率和存活率，优于其他各对照处理组，这其中也包括现有专利cn105850979a冻存保护液。基于上述有益效果，本发明提供了所述冻存保护液在冻存软骨细胞以及制备软骨细胞冻存保护产品中的应用。此外，本发明还提供了一种冻存软骨细胞的方法，将需冻存的软骨细胞按常规方法消化离心后，加入胎牛血清，调整细胞密度至(0.1-10)×106个/ml加入等体积的本发明所述冻存保护液，混匀后，分装至冻存管中，置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中1到5天，转移至液氮中长久保存。在具体实施方式中，上述方法可以具体为：将需冻存的软骨细胞加0.015ml/cm2的0.25％的胰酶和0.04％edta消化2min，用10倍于消化液的含胎牛血清的低糖dmem培养基终止酶解，取样计数，200g离心5min去上清，用胎牛血清重悬细胞沉淀至细胞密度为4×106个/ml，轻轻吹打均匀后，加入等体积的本发明所述冻存保护液，混匀后，分装至冻存管中，置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中1到5天，转移至液氮中长久保存。由以上技术方案可知，本发明以dmso、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子作为冻存保护液的组分，通过各组分的相互作用，可有效保护软骨细胞冻存，并在复苏后维持软骨细胞回收率和存活率在较高水平，同时提高细胞增殖能力，显著优于同类保护液。附图说明图1所示为不同冻存保护液处理后的软骨细胞生长曲线。具体实施方式本发明实施例公开了一种软骨细胞冻存保护液及其应用和软骨细胞冻存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明产品和应用已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下就本发明所提供的一种软骨细胞冻存保护液及其应用和软骨细胞冻存方法做进一步说明。实施例1：脐带间充质干细胞生长因子的制备取p1-p5代的脐带间充质干细胞，用低糖dmem+10％fbs进行大规模培养，接种于培养皿或培养瓶中，接种密度1-10×105cell/ml；当细胞生长融合度达80％以上时，收集细胞并以pbs清洗细胞两遍，换用1640培养基继续培养细胞，3天一换液，至细胞生长融合度达80％以上时，收集培养细胞的培养基，先经0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质，滤液再经0.22μm滤膜过滤浓缩并除去3kda以下小颗粒物质(浓缩过程采用slice200切向流器，循环过滤的时间为3h)，滤液浓缩至蛋白质浓度为1000mg/l时冻干，获得生长因子。实施例2：本发明所述冻存保护液1、配方(1)dmso、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子，dmso和胎牛血清的体积比为1:9，脐带间充质干细胞生长因子浓度为1mg/ml；(2)dmso、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子，dmso和胎牛血清的体积比为1:4，脐带间充质干细胞生长因子浓度为2mg/ml；2、配制方法按配方中比例，用胎牛血清将干细胞生长因子溶解并混合均匀，再加入dmso，后置于冰水浴中至冻存液温度将近于0摄氏度。实施例3：软骨细胞冻存复苏试验1、冻存液分组a组：实施例2配方1冻存保护液；b组：dmso+fbs，两者体积比1:4；c组：dmso+fbs+低糖dmem(含10％fbs)，三者体积比1:2:2；d组：专利cn105850979a实施例2冻存保护液；e组：dmso+fbs+脐带间充质干细胞条件培养基，三者体积比为1:4:5，脐带间充质干细胞条件培养基按照专利cn105850979a实施例1第2部分条件培养基方法制备，区别在于以脐带间充质干细胞替换骨髓间充质干细胞；2、试验方法取汇合度80％的p2代的软骨细胞，用pbs洗2遍后，往细胞中加0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％edta消化2min，用10倍于消化液的完全培养基(含10％fbs的低糖dmem)终止酶解，取样计数，200g离心5min,去上清，用胎牛血清重悬细胞沉淀至细胞密度为4×106cell/ml，轻轻吹打均匀后，将细胞悬液平均分为五管。分别加入等体积的a-e五组配方的冻存保护液。轻轻吹打均匀后，分装后，置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中3天，转移至液氮中，半年后取出复苏，计算回收率，细胞活率，以及细胞增殖情况。①细胞回收率＝复苏后细胞数/冻存时候细胞数*100％②细胞活率，细胞复苏后取样，用0.4％台盼蓝1：1染色后，置于显微镜下，计算活细胞数，及死细胞数，细胞活率＝活细胞数/总细胞数*100％③细胞增殖情况，把复苏后的细胞，按10000个细胞每孔接种于12孔板中，连续培养，每天取样计数，作三个重复，观察细胞的增殖情况。结果见表1和图1。3、结果表1组别a组b组c组d组e组细胞回收率95.13％88.12％94.26％92.31％92.16％细胞活率96.35％83.98％76.55％89.93％89.53％由表1可知，在细胞回收率和细胞活率两方面效果上，仅有本发明冻存液能够同时实现较高的效果，而其他各组均无法实现。由图1可知，由本发明冻存液冻存后，复苏的细胞增殖效率也较高，优于其他各组。以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。当前第1页12