本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种草酸青霉菌剂及其制备方法和在防治果蔬主要病害中的应用。
背景技术：
桃褐腐病、细菌性穿孔病、猕猴桃溃疡病、苹果轮纹病等植物病原真菌对农作物危害严重，防治难度大。目前化学农药是预防和治疗植物病害的有效手段，在保障农作物高产和稳产方面发挥了巨大的作用。但传统化学农药的长期大量不合理使用所造成残留、抗性和再猖獗，引起社会的普遍关注。寻求和开发对人类健康及生态安全的新型农药越来越迫切。
液膜萃取法兼有溶剂萃取和膜渗透两项技术特点，按其结构可分为乳化液膜(emulsionliquidmembrane)和支撑液膜(supportedliquidmembrane)两大类。乳化液膜为液体表面活性剂形成的球面，将溶液分为内相和外相，液膜只有几个分子厚，单位体积的表面积可达1000-3000m2/m3，具有萃取速度快、分离与浓缩一步完成、能从低浓度溶液中有效回收溶质等优点，但液膜的稳定性问题较难解决。支撑液膜是将起分离作用的液相借助毛细作用固定在多孔高分子膜中。支撑液膜可使萃取与反萃取在液膜的两侧同时进行，从而避免载体负荷的限制、减少有机相的使用量，解决了乳化液膜的乳化液稳定条件及破乳等问题。本发明采用支撑液膜。
在植物病害的生物防治中研究和应用较多的微生物主要有细菌类、真菌类和放线菌。真菌主要有木霉菌(trichoderma)(如哈茨木霉(t.harzianum)、康氏木霉(t.koningii)、绿色木霉(t.viride)等)、青霉、丝核菌、酵母菌、粘帚霉、盾壳霉等。有研究报道从桃枝分离的penicilliumpurpurogenum对桃褐腐病原菌有很好防效；淡紫拟青霉对南方根结线虫(meloidogyneincognita)、孢囊线虫(heteridera)、白色球包囊线虫(globoderpallida)、穿刺线虫(tylenchulus)、金色线虫、异皮线虫和珍珠线虫(nacobbus)有很强的寄生能力，通过提高植物自身抗病能力来抑菌(jatalap.biologicalcontrolofplant-parasiticnematodes[j].annrevphytopathol,1986,24:452-489)；申光辉等筛选到灰黄青霉(penicilliumgriseofulvum)和土曲霉(aspergillusterreus)两种拮抗真菌对草莓根腐病有较强的拮抗作用(申光辉，薛泉宏，张晶等，草莓根腐病拮抗真菌筛选鉴定及其防病促生作用[j].中国农业科学，2012(22)：4612-4626)；王国平等从南方红豆杉分离出一种新内真菌紫杉木霉菌株，用于治疗水稻纹枯病(王国平，鲁书玲，郑必强等.内生真菌紫杉木霉zjuf0986菌株及其活性代谢产物防治水稻纹枯病的效果[j].中国生物治2009(01)：30-34)；同时也有生物农药草酸青霉水剂对玉米小斑病的防治研究(王勇，张文革，何璐等.生物农药草酸青霉水剂对玉米小斑病的防治效果[j].安徽农业科学，2007，35(7)：1965-1966)，草酸青霉对大豆胞囊线虫的防治也有报道。(李婷，黄文坤，彭德良等。3种防真菌发酵液对大豆包囊线虫的防治效果[j].华中农业大学学报，2017，01(007)：42-46)。然而，关于草酸青霉在果蔬主要病害猕猴桃溃疡病、细菌性穿孔病、苹果轮纹病、桃褐腐病上的防治研究及应用未见报道。松花粉为松科植物马尾松pinusmassonianalamb.、油松pinustabuliformiscarr.或同属数种植物的干燥花粉，含有丰富的蛋白质、类脂、氨基酸、多种微量元素、维生素、酶、色素及抗菌素等，以松花粉为营养培养草酸青霉菌增强杀菌能力的研究未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种草酸青霉菌菌剂的制备方法，该方法通过种子培养、扩大培养、液膜萃取获得可具有防治果蔬主要病害的草酸青霉菌菌剂。
本发明的另一目的在于提供一种采用上述方法制备的草酸青霉菌菌剂。
本发明的第三个目的在于提供上述草酸青霉菌菌剂的应用。
为了实现上述目的，本发明提供一种草酸青霉菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1)种子培养：将草酸青霉菌接种到加味pda液体培养基，25-28℃摇床180r/min培养7d得到草酸青霉菌培养液；
2)按10％接种量将步骤1)培养的草酸青霉菌培养液接种到加味pda液体培养基，25-28℃摇床180r/min培养24h制成草酸青霉悬浮液；
3)扩大培养：将草酸青霉悬浮液按体积比1：25～30接种到生产罐培养基中，通气量2l/min，25-28℃发酵罐200r/min发酵72h获得发酵液；
4)在发酵液中加入2％的200目天花粉，吸附15-30min，然后用纱布过滤，滤过菌丝和孢子及其他不溶物，得发酵预处理液；
本步骤中天花粉对发酵液进行一个初步吸附，主要吸附杂质，经纱布过滤时天花粉吸附的成分会被纱布过滤除掉。
5)液膜萃取：将发酵预处理液用双蒸水稀释u＝500mg/l，体系采用celgard-2500-30％tfa液膜，ph＝6-8(优选ph＝7)、30℃、转速400-500r/min，温度28±3℃，添加na2co3溶液至终浓度为15％na2co3，得萃取液。
celgard-2500-30％tfa液膜是在celgard-2500两面涂覆30％tfa(三氟乙酸)制成。
其中，所述加味pda液体培养基配方为：去皮土豆200g、葡萄糖20g、松花粉20g、维生素c0.5g、用蒸馏水定容到1000ml。
灭菌时将加味pda液体培养基中除维生素c以外的成分110-121℃灭菌25min，冷却至室温，维生素c过滤灭菌后加入到培养基中即可。
加味pda液体培养基在现有pda培养基基础上增加了松花粉和维生素c，其中松花粉是松树花蕊的精细胞，含多种蛋白质、氨基酸、矿物质、酶与辅酶、核酸、单糖、多糖等200余种营养成份，且具有抗菌效果，为草酸青霉菌提供生长所需营养，维生素c促进草酸青霉的生长。
其中，所述生产罐培养基配方为：玉米面1500g、40目玉米秸秆粉12000g、松花粉620g、k2hpo4600g、feso41.5g、加水至30000ml，121℃灭菌30min。
在扩大培养的培养基中添加松花粉，其中松花粉具有抗菌效果，同时为草酸青霉菌提供生长所需营养。
其中，所述草酸青霉菌菌剂加入辅料制成喷雾剂、烟雾剂、水剂、乳化剂、可湿性粉剂、粉剂、颗粒剂、片剂或泡腾剂。
本发明还提供上述制备方法制备的草酸青霉菌菌剂。
本发明还提供上述草酸青霉菌菌剂在抑制桃褐腐、细菌性穿孔病、苹果轮纹病、马铃薯干腐病、猕猴桃溃疡病中的应用。
草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)，该菌分生孢子梗直立，高度为100-200μm、无色、有分隔、具有刷状小梗、小梗丛生于分支顶端呈花束状、分生孢子呈链状生长、球形至椭圆形、无色至着色、光滑，大4.5-6.5×3.0-4.0μm；菌落先呈散点状,生长后成片；菌落边缘淡白色、不光滑，孢子形成后淡黄绿至墨绿色。草酸青霉菌以含松花粉的培养基发酵，发酵液采用液膜萃取处理，制备具防治桃褐腐病、细菌性穿孔病、苹果轮纹病、马铃薯干腐病、猕猴桃溃疡病的杀菌剂。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的一种草酸青霉菌剂制备方法制备的草酸青霉菌剂具有选择性高、易降解、用量少、污染小、对人畜毒性小、环境兼容性好、不易产生抗性等优点。同时，生物液膜萃取法处理的草酸青霉发酵液制剂为水基性环保制剂，具有对环境和施药者安全，无有机溶剂和粉尘，减少了对环境的污染。该种草酸青霉制剂可通过单一菌株防治多种果蔬病害，对猕猴桃溃疡病、细菌性穿孔病、苹果轮纹病、马铃薯干腐病和桃褐腐病等多种果蔬病害的抑菌率达90％以上，抗菌谱广，可有效降低防治成本。
具体实施方式
材料与试剂：
1.草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)由北京化工大学田平芳教授惠赠。
2.celgard-2500购买自美国celgard公司，使用时在celgard-2500两面涂覆30％tfa(三氟乙酸)，制成celgard-2500-30％tfa液膜。
3.引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。
4.测序由北京博迈德科技发展有限公司进行。
培养基：
1.加味pda液体培养基
去皮土豆200g、葡萄糖20g、松花粉20g、维生素c0.5g、蒸馏水定容到1000ml，灭菌时将加味pda液体培养基中除维生素c以外的成分121℃灭菌25min，冷却至室温，维生素c过滤灭菌后加入到培养基中即可。
2.加味pda固体培养基
去皮土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、松花粉20g、维生素c0.5g、蒸馏水定容到1000ml。
灭菌时将加味pda固体培养基中除维生素c以外的成分121℃灭菌25min，冷却至室温，维生素c过滤灭菌后在琼脂凝固前加入到培养基中混匀即可。
3.生产罐培养基配方为：玉米面1500g、40目玉米秸秆粉12000g、松花粉620g、k2hpo4600g、feso41.5g、加水至30000ml，121℃灭菌30min。
4.pda固体培养基
去皮土豆200g、葡萄糖20g，琼脂粉15g蒸馏水定容到1000ml。
灭菌时将pda固体培养基121℃灭菌25min。
5.羧甲基纤维素钠(cmc-na)鉴别固体培养基
cmc-na20g；na2hpo42.5g；kh2po41.5g；蛋白胨2.5g；琼脂2g；蒸馏水1000ml；ph7.2～7.4。
本发明所用草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)由北京化工大学田平芳教授惠赠，并在使用前对菌株进行复核鉴定。
实施例1草酸青霉菌的复核鉴定
一、形态学鉴定
将菌落接种在羧甲基纤维素钠(cmc-na)鉴别固体培养基上进行菌落形态观察和显微镜镜检。该菌株在羧甲基纤维素钠(cmc-na)鉴别固体培养基培养后，菌落起初灰绿色，均匀分布在培养基表面，呈轮纹状，边缘无色半透明，菌落背面青绿色或者墨绿色。显微镜下可见菌丝无色，分生孢子梗散生，从菌丝垂直生出，分生孢子梗长柱状，分生孢子梗下部不分支；有横隔膜，分生孢子梗顶端生排列成帚状的间枝，间枝顶层为小梗，小梗具瓶梗3个，顶生呈串不分枝的链状分生孢子，分生孢子光滑近圆形，蓝绿色。根据《真菌鉴定手册》鉴定为半知菌亚门(deuteromyeotina)、丝孢纲(hypholnseetes)、丝孢目(moniliales)、丛梗孢科(moniliaceae)、青霉属(penicillium)菌株。
二、its鉴定
1.pcr模板的获取：提取基因组dna将其作为pcr模板
提取基因组dna，采用ctab法，具体如下：
1)取液氮冷冻过的菌体50-100mg，本实施例中使用100mg，研钵研磨后加入2.0ml离心管中；
2)迅速加入65℃预热过的ctab800μl(2％ctab使用前加入0.5-1％β-巯基乙醇)，混合均匀后放入65℃水浴一小时。每十分钟摇动一次，使ctab与菌体充分混匀；
3)取出离心管至常温，放置2min后加入800ml氯仿/异戊醇(24：1)混合液，将混合液与ctab混匀后缓缓摇动1-2min，使ctab与氯仿充分接触；
4)12000rpm离心5-10min，小心吸取上清液至新的2.0ml离心管中，再次加入700μl氯仿/异戊醇混合液，缓缓混匀1-2min，再次离心，吸取上清液至1.5ml离心管中；
5)迅速向1.5ml离心管中加入等体积的-20℃预冷过的异丙醇，混匀，-20℃放置2h左右；
6)将－20℃保存的离心管取出，12000rpm离心5-10min，弃去液体；
7)加入1ml70％乙醇洗涤dna沉淀，风干；
8)风干后用30-60μlddh2o溶解，待用。
2.pcr
pcr引物采用真菌its通用引物
its1(seqidno.1)：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’；
its4(seqidno.2)：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’
pcr反应体系25μl：2×taqpcrmix12.5ml，引物its11μl，引物its41μl，ddh2o8.5μl，dna模板2μl。
pcr程序：94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃90s，30个循环；72℃10min。
pcr结束后采用1％琼脂糖凝胶电泳，pcr产物为606bp，经纯化回收后测序，测序结果用dnamanversion5.2.2和blast软件与genbank中的序列进行同源性比对，证实该菌为草酸青霉菌。
草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)，用50％(v/v)甘油作为保护剂，-80℃长久保藏。
实施例2草酸青霉菌的培养基筛选
草酸青霉菌在无菌操作条件下用8mm的打孔器，选择菌落较为单一整齐处打孔，得大小一致的菌饼5个，加到100ml加味pda液体培养基中，在25℃下180r/min的摇床上培养7d，按10％的接种量将其转接到下一批加味pda液体培养基中，继续培养7d，之后再按10％的接种量将其转接到下一批加味pda培养基中，继续培养7d，按此方法转接5次后，取培养液0.1ml转接到加味pda固体培养皿，涂布平板，置于25℃恒温培养箱中培养48h，选取菌落较为单一整齐的单菌落接种于加味pda固体培养基上培养。
同时用pda培养基重复以上操作。
实施例3：草酸青霉与多种植物病原菌体平板对峙试验(普通pda培养基)
制备直径8mm的病原菌饼和草酸青霉菌饼，病原菌饼(8mm)和拮抗菌饼(8mm)等距离放置在普通pda培养基培养基中心两侧，形成一条直线；未放拮抗菌的为空白对照。每处理重复5次，置25℃恒温培养箱培养，5天后观察抑菌圈大小，用十字交叉法测量菌落直径。结果见表1。结果表明，草酸青霉对桃褐腐病菌、苹果轮纹病菌、马铃薯干腐病菌、细菌性穿孔病的拮抗作用在35-52％之间，明显小于培养基加松花粉的抑制率。
表1草酸青霉菌与植物病原菌(培养基不加松花粉)对峙及抑制作用
注：对峙直径(病原真菌与草酸青霉共培养时病原真菌的直径)
所述病原真菌具体为桃褐腐病菌、苹果轮纹病菌细菌性穿孔病、猕猴桃溃疡病。抑菌率％＝[(空白菌落直径-8)－(对峙菌落直径-8)]×100％/(空白菌落直径－8)
实施例4：加味pda液体培养
草酸青霉菌液体培养：将100ml草酸青霉菌株接种到灭菌的加味pda液体培养基1000ml中，28℃，180r/min，振荡培养24h，制成草酸青霉悬浮液。
生产罐培养基各组分配方包括：玉米面1500g、玉米秸秆粉(40目)12000g、松花粉620g、k2hpo4600g、feso41.5g、维生素c1.5g、加水至30000ml。将30000ml液体培养基倒入50000ml发酵罐，于121℃灭菌30min，取出后冷却至室温，接上草酸青霉悬浮液100ml，初始ph5，于28℃，200r/min发酵72h。
po1液膜萃取液配制：发酵液加天花粉600g吸附。采用celgard-2500-30％tfa液膜，po1发酵液用纱布过滤，滤过菌丝和孢子及其他不溶物，得发酵预处理液，用双蒸水稀释u＝500mg/l，ph＝7、30℃、转速400r/min，采用15％na2co3溶液提取，得萃取液(原药)。
实施例5：草酸青霉水剂的制备
取萃取液和50％氢氧化钠各300ml混合，加热至45℃，反应1h，调ph值至7.0，加防冻液甘油5ml、防腐剂乙醇5ml混合，得水剂。
水质选择：蒸馏水和不同区域的井水、自来水和蒸馏水，试验结果表明，不同水质对配制草酸青霉水剂无不良影响。
通过增加助剂增加靶标生物上的扩展面积，促进制剂快速吸收，提高耐雨水冲刷能力，毒性小，对环境安全等特点。
实施例6：液膜萃取发酵液对细菌性穿孔病的防治效果
试验分2组：对照为pda培养基、生产培养基不加松花粉、不用天花粉吸附剂、发酵液未经支撑液膜萃取的发酵液；试验组加味pda培养基、生产培养基加松花粉、用天花粉吸附剂、发酵液采用经支撑液膜萃取的op1发酵液；将该两组对照分别制成500倍液，在北京14号桃树初花期(花开约20％时)喷一次，落花后10天喷一次，在第二次喷药后30天观察细菌性穿孔病防治效果，结果表明，对照组发酵液防效61.2％，支撑液膜萃取后的试验组发酵液防效94.5％。
实施例7：液膜萃取发酵液对苹果轮纹病的防治效果
试验分2组：对照为pda培养基、生产培养基不加松花粉、不用天花粉吸附剂、发酵液未经支撑液膜萃取的发酵液；试验组为加味pda培养基、生产培养基加松花粉、用天花粉吸附剂、发酵液采用op1发酵液。将该两组对照分别制成500倍液，于10月20日富士苹果喷一次，10天后喷一次，在第二次喷药后10天观察苹果轮纹病防治效果，结果表明，对照组发酵液防效72.6％，支撑液膜萃取后的试验组发酵液防效96.7％。
实施例8：液膜萃取发酵液对桃褐腐病的防治效果
试验分两组：对照为pda培养基、生产培养基不加松花粉、不用天花粉吸附剂、发酵液未经支撑液膜萃取的发酵液；试验组为加味pda培养基、生产培养基加松花粉、用天花粉吸附剂、发酵液采用op1发酵液。将该两组对照分别制成1000倍液，于7月13日大久保桃树喷一次，10天后喷一次，在第二次喷药后10天观察对桃褐腐病防治效果，结果表明，对照组发酵液防效75.8％，支撑液膜萃取后的发酵液防效91.5％。
实施例9：液膜萃取发酵液对猕猴桃溃疡病的防治效果
试验分两组：对照为pda培养基、生产培养基不加松花粉、不用天花粉吸附剂、发酵液未经支撑液膜萃取的发酵液；试验组加味pda培养基、生产培养基加松花粉、用天花粉吸附剂、发酵液采用op1发酵液。将该两组对照分别制成500倍液，在久美2号猕猴桃树初花期(花开约20％时)喷一次，落花后10天喷一次，在第二次喷药后30天观察猕猴桃溃疡病防治效果，结果表明，未经过支撑液膜萃取的对照组发酵液防效66.1％，支撑液膜萃取后的试验组发酵液防效93.7％。
实施例10：液膜萃取发酵液对马铃薯干腐病的防治效果
试验分两组：对照为pda培养基、生产培养基不加松花粉、不用天花粉吸附剂、发酵液未经支撑液膜萃取的发酵液；试验组为加味pda培养基、生产培养基加松花粉、用天花粉吸附剂、发酵液采用op1发酵液。将该两组对照分别制成1000倍液，于4月12日费乌瑞它马铃薯喷一次，10天后喷一次，在第二次喷药后10天观察对马铃薯干腐病防治效果，结果表明，对照组发酵液防效73.8％，支撑液膜萃取后的发酵液防效94.7％。
试验时间：2014.3-2016年3月。
本发明所示的草酸青霉盆栽实验和田间实验表明经过支撑液膜处理的草酸青霉发酵液对果蔬常见病害的致病菌抑制效果均可以达到92％以上。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
sequencelisting
<110>北京联合大学
<120>一种草酸青霉菌剂及其制备方法和应用
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