一种具选择性杀灭微囊藻促有益浮游藻生长的组合药物的制作方法

技术背景

随着淡水养殖业的发展，养殖水体富营养化程度不断加剧，微囊藻水华频发，不仅直接影响养殖对象的正常生长发育，降低养殖对象的产量和质量，严重时还会造成养殖对象大量死亡，为养殖户带来巨大的经济损失。养殖水环境的特殊性对养殖水体微囊藻水华治理提出了更高的要求。

浮游藻类作为初级生产者，养殖水体中95%溶解氧来源于浮游藻类的光合作用，因此，维持浮游藻类群落结构对优化养殖水质至关重要。目前，化学药剂杀藻是养殖水体微囊藻水华应急治理的主要方法。但实际应用中常用的铜制剂、二氧化氯、漂白粉等化学杀藻剂对靶标微囊藻无选择性抑杀作用，即在杀灭微囊藻的同时也会抑杀非靶标藻类如绿藻等，会对浮游藻类群落结构造成毁灭性破坏。因此，特异性杀灭微囊藻的选择性抑藻剂的研发已经迫在眉睫。

微囊藻等蓝藻属于原核生物，没有叶绿体，光合作用片层结构--类囊体直接暴露于细胞质中。与蓝藻不同，绿藻等有益藻类属于真核自养生物，其光合作用场所位于叶绿体内。叶绿体外被包膜由内外两层膜组成，对各种各样的物质和离子具有选择透过性。光合作用抑制型杀藻剂作用靶点位于光合系统上，如果不能透过真核藻类的叶绿体包膜进入叶绿体，那么就无法发挥抑杀作用，进而特异性选择抑杀光合作用场所暴露于细胞质中的微囊藻。小檗碱对微囊藻的抑杀效应具有光依赖性，作为光合作用抑制型杀藻剂可能发挥选择性杀藻效应。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种对有益藻无抑制作用且可杀灭微囊藻的杀藻组合药物及其制备方法。

本发明一种具选择性杀灭微囊藻促有益浮游藻生长的组合药物，主要成分中含有下述重量配比的原料：小檗碱80-90份，赤霉素80-90份，β-环糊精30-40份，羟丙基环糊精20-30份，羟丙基甲纤维素k4m为10-30份，低取代羟丙基纤维素10-30份。

本一种具选择性杀灭微囊藻促有益浮游藻生长的组合药物制备方法，按照以下步骤进行：

(1)将按重量分数比为（40:50）/（40:50）的小檗碱和赤霉素按比例混匀后研磨，过筛粒径小于5μm，真空干燥1小时，得粉末a；

(2)40℃下，将纯净水分别与β-环糊精，羟丙基环糊精按照v/w为1000:20(ml:g)的比例溶解，混匀后得溶液a；

(3)70-90℃，将粉末a与混合溶液a按照w/w为20:100（g:g）溶解，恒温溶解10min，得已被增溶的小檗碱溶液b；

(4)将改性磷灰石/壳聚糖放置在已抽成真空的真空容器中，将其孔隙中的气体吸出后停止抽真空，向真空容器中注入步骤（3）中的小檗碱，把抽好真空的改性磷灰石/壳聚糖和小檗碱混合均匀，逐渐降低真空度至常压状态，使小檗碱尽可能多的被吸进到改性磷石灰/壳聚糖孔隙之中，得混合溶液c。

(5)将羟丙基甲纤维素k4m，低取代羟丙基纤维素粉碎干燥混合后后，按照w/v比为2:30质量体积比加入到混合溶液c中，交联反应，得本杀藻剂。

(6)上述反应结束后用10mol·l^-1的naoh溶液调节ph至9.0，离心并用蒸馏水洗涤数遍，冷冻干燥，得到淡黄色固体粉末即为杀藻剂冻干粉。

所述改性磷灰石/壳聚糖复合物为经焦磷酸钛酸酯偶联后的多孔生物材料；焦磷酸钛酸酯偶联剂中的-o-官能团能与壳聚糖填料发生交联反应，材料的抗压强度得到提高，填料添加量可达到50%以上，孔隙率可以提高至84.8%，容重为40～150公斤/立方米，孔隙层呈错板条搭接，分布较均匀，磷酸三钙颗粒均匀分散在cs模板上。

所述将改性磷灰石/壳聚糖复合生物材料放置在真空容器中抽真空过程中，使复合生物材料在70度～300度环境中被抽真空，停止抽真空后，将环境温度降在70℃～150℃条件下，向真空容器中注入杀藻剂，把复合生物材料和杀藻剂混合均匀，逐渐降低真空度至常压状态。这是在70℃～300℃加温状态下抽真空的方法，目的在于可使复合生物材料中的气体膨胀，加快抽真空的时间，又可在70℃～130℃条件下注入小檗碱混均匀后，从70℃～130℃温度下降到室温过程中，生物材料的孔隙深处气体收缩产生负压，自动吸入小檗碱颗粒，以便嵌入更多的小檗碱在孔隙深处，提高对小檗碱的缓释效果。

本发明具有以下优点：

（1）常用的铜制剂、二氧化氯、漂白粉等化学杀藻剂对靶标微囊藻无选择性抑杀作用，即在杀灭微囊藻的同时也会抑杀非靶标藻类（如绿藻等），会对浮游藻类群落结构造成毁灭性破坏，杀藻同时降低养殖对象的成活率。而本发明药物组方通过制成缓释剂可以精确控制小檗碱释放量，减少有益藻的应激反应，避免高浓度条件下微囊藻形成休眠孢子以致于不能被彻底杀灭；通过辅以赤霉素增加有益藻特别是绿藻的生长，绿藻的密度提高也可以辅助杀灭微囊藻，使水体环境不利于微囊藻的爆发。

（2）常用的小檗碱杀藻剂存在药物浓度低，生物利用率不高的缺点，而本发明利用对改性磷灰石/壳聚糖复合物微孔环境真空的变化，促进小檗碱尽量多的被吸进到孔隙中，即充分利用改性磷灰石/壳聚糖复合生物材料的载体功能，又使小檗碱在特别的物理空间中更不易被水流失，即有缓释小檗碱、充分利用小檗碱资源、减少浪费，又减少大量释放小檗碱对水库和江河的污染。

（2）本发明比现在简单把改性磷灰石/壳聚糖复合生物材料和小檗碱混合只增加了抽真空工艺和成本，但使小檗碱在水域中的可利用时间延长，增加小檗碱利用率，减少了小檗碱污染。在小檗碱被利用完后，改性磷灰石/壳聚糖复合生物材料在养殖水体底泥中还有改善底泥透气性，再吸进底泥营养成分缓释的重复利用效果。

（3）小檗碱难溶于水不是由于疏水基团造成的，采用聚乙二醇4000等增溶剂效果并不明显，本发明中，小檗碱可以附着于环糊精的空腔内，提高了分散性，可使小檗碱溶解度提高约4倍。另一方面，由于改性磷灰石/壳聚糖复合生物材料和缓释系统的运用，缓释和控释技术显著增加了小檗碱在水体内释放的速度和程度，同样有利于提高小檗碱长效缓释制剂的生物利用度。因此，用本发明的方法获得的杀藻制剂既是一种长效缓释制剂，也是一种高效制剂，是兼具“高效与长效”双重优点的新型缓释制剂。结果表明：本发明的方法制备的长效缓释制剂相对生物利用度为383%。可用于3天给药1次的现代高效长效缓释制剂开发。

附图说明

图1组合药物作用下铜绿微囊藻的生长变化

图2组合药物作用下小球藻的生长变化

图3组合药物作用下铜绿微囊藻的超微结构变化

图4组合药物作用下小球藻的超微结构变化

图5组合药物对模拟微生态系统浮游植物细胞密度和草金鱼成活率的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明

实施例1

本发明对有益藻无抑制作用且可杀灭微囊藻的杀藻剂，主要成分中含有下述重量配比的原料：小檗碱80份，赤霉素80份，β-环糊精30份，羟丙基环糊精30份，羟丙基甲纤维素k4m为20份，低取代羟丙基纤维素20份。

本对有益藻无抑制作用且可杀灭微囊藻的杀藻剂制备方法，按照以下步骤进行：

(1)将按重量分数比为50/50的小檗碱和赤霉素按比例混匀后研磨，过筛粒径为4.5±0.5μm，真空干燥1小时，得粉末a；

(2)40℃下，将纯净水分别与β-环糊精，羟丙基环糊精按照v/w为1000:20(ml:g)的比例溶解，混匀后得溶液a；

(3)70-90℃，将粉末a与混合溶液a按照w/w为20:100（g:g）溶解，恒温溶解10min，得已被增溶的小檗碱溶液b；

(4)将改性磷灰石/壳聚糖放置在已抽成真空的真空容器中，将其孔隙中的气体吸出后停止抽真空，向真空容器中注入步骤（3）中的小檗碱，把抽好真空的改性磷灰石/壳聚糖和小檗碱混合均匀，逐渐降低真空度至常压状态，使小檗碱尽可能多的被吸进到改性磷石灰/壳聚糖孔隙之中，得混合液c。

(5)将羟丙基甲纤维素k4m，低取代羟丙基纤维素粉碎干燥混合后后，按照w/v比为2:30质量体积比加入到混合溶液c中，交联反应，得本杀藻剂。

(6)上述反应结束后用10mol·l^-1的naoh溶液调节ph至9.0，离心并用蒸馏水洗涤数遍，冷冻干燥，得到淡黄色固体粉末即为杀藻剂冻干粉。

所述改性磷灰石/壳聚糖复合物为经焦磷酸钛酸酯偶联后的多孔生物材料；焦磷酸钛酸酯偶联剂中的-o-官能团能与壳聚糖填料发生交联反应，材料的抗压强度得到提高，填料添加量可达到50%以上，孔隙率可以提高至84.1%，容重为100公斤/立方米，孔隙层呈错板条搭接，分布较均匀，磷酸三钙颗粒均匀分散在cs模板上。

所述将改性磷灰石/壳聚糖复合物放置在真空容器中抽真空过程中，使复合生物材料在300度环境中被抽真空，停止抽真空后，将环境温度降在150℃条件下，向真空容器中注入杀藻剂，把复合生物材料和杀藻剂混合均匀，逐渐降低真空度至常压状态。这是在70℃～300℃加温状态下抽真空的方法，目的在于可使复合生物材料中的气体膨胀，加快抽真空的时间，又可在130℃条件下注入小檗碱混均匀后，从130℃温度下降到室温过程中，生物材料的孔隙深处气体收缩产生负压，自动吸入小檗碱颗粒，以便嵌入更多的小檗碱在孔隙深处，提高对小檗碱的缓释效果。

实施例2

本发明对有益藻无抑制作用且可杀灭微囊藻的杀藻剂，主要成分中含有下述重量配比的原料：小檗碱90份，赤霉素85份，β-环糊精40份，羟丙基环糊精30份，羟丙基甲纤维素k4m为30份，低取代羟丙基纤维素30份。

本对有益藻无抑制作用且可杀灭微囊藻的杀藻剂制备方法，按照以下步骤进行：

(1)将按重量分数比为40/60的小檗碱和赤霉素按比例混匀后研磨，过筛粒径4.5±0.3μm，真空干燥1小时，得粉末a；

(2)40℃下，将纯净水分别与β-环糊精，羟丙基环糊精按照v/w为1000:20(ml:g)的比例溶解，混匀后得溶液a；

(3)70-90℃，将粉末a与混合溶液a按照w/w为20:100（g:g）溶解，恒温溶解10min，得已被增溶的小檗碱溶液b；

(4)将改性磷灰石/壳聚糖放置在已抽成真空的真空容器中，将其孔隙中的气体吸出后停止抽真空，向真空容器中注入步骤（3）中的小檗碱，把抽好真空的改性磷灰石/壳聚糖和小檗碱混合均匀，逐渐降低真空度至常压状态，使小檗碱尽可能多的被吸进到改性磷石灰/壳聚糖孔隙之中，得混合液c。

(5)将羟丙基甲纤维素k4m，低取代羟丙基纤维素粉碎干燥混合后后，按照w/v比为2:30质量体积比加入到混合溶液c中，交联反应，得本杀藻剂。

(6)上述反应结束后用10mol·l^-1的naoh溶液调节ph至9.0，离心并用蒸馏水洗涤数遍，冷冻干燥，得到淡黄色固体粉末即为杀藻剂冻干粉。

所述改性磷灰石/壳聚糖复合物为经焦磷酸钛酸酯偶联后的多孔生物材料；焦磷酸钛酸酯偶联剂中的-o-官能团能与壳聚糖填料发生交联反应，材料的抗压强度得到提高，填料添加量可达到50%以上，孔隙率可以提高至84.8%，容重为120公斤/立方米，孔隙层呈错板条搭接，分布较均匀，磷酸三钙颗粒均匀分散在cs模板上。

所述将改性磷灰石/壳聚糖复合物放置在真空容器中抽真空过程中，使复合生物材料在200度环境中被抽真空，停止抽真空后，将环境温度降在120℃条件下，向真空容器中注入杀藻剂，把复合生物材料和杀藻剂混合均匀，逐渐降低真空度至常压状态。这是在200℃加温状态下抽真空的方法，目的在于可使复合生物材料中的气体膨胀，加快抽真空的时间，又可在90℃条件下注入小檗碱混均匀后，从90℃温度下降到室温过程中，生物材料的孔隙深处气体收缩产生负压，自动吸入小檗碱颗粒，以便嵌入更多的小檗碱在孔隙深处，提高对小檗碱的缓释效果。

实施例3

本发明对有益藻无抑制作用且可杀灭微囊藻的杀藻剂，主要成分中含有下述重量配比的原料：小檗碱85份，赤霉素90份，β-环糊精35份，羟丙基环糊精25份，羟丙基甲纤维素k4m为10份，低取代羟丙基纤维素10份。

本对有益藻无抑制作用且可杀灭微囊藻的杀藻剂制备方法，按照以下步骤进行：

(1)将按重量分数比为55/45的小檗碱和赤霉素按比例混匀后研磨，过筛粒径4.5±0.3μm，真空干燥1小时，得粉末a；

(2)40℃下，将纯净水分别与β-环糊精，羟丙基环糊精按照v/w为1000:20(ml:g)的比例溶解，混匀后得混合溶液a；

(3)70-90℃，将粉末a与混合溶液a按照w/w为20:100（g:g）溶解，恒温溶解10min，得已被增溶的小檗碱溶液b；

(4)将改性磷灰石/壳聚糖放置在已抽成真空的真空容器中，将其孔隙中的气体吸出后停止抽真空，向真空容器中注入步骤（3）中的小檗碱，把抽好真空的改性磷灰石/壳聚糖和小檗碱混合均匀，逐渐降低真空度至常压状态，使小檗碱尽可能多的被吸进到改性磷石灰/壳聚糖孔隙之中，得混合液c。

(5)将羟丙基甲纤维素k4m，低取代羟丙基纤维素粉碎干燥混合后后，按照w/v比为2:30质量体积比加入到溶液c中，交联反应，得本杀藻剂。

(6)上述反应结束后用10mol·l^-1的naoh溶液调节ph至9.0，离心并用蒸馏水洗涤数遍，冷冻干燥，得到淡黄色固体粉末即为杀藻剂冻干粉。

所述改性磷灰石/壳聚糖复合物为经焦磷酸钛酸酯偶联后的多孔生物材料；焦磷酸钛酸酯偶联剂中的-o-官能团能与壳聚糖填料发生交联反应，材料的抗压强度得到提高，填料添加量可达到60%，孔隙率可以提高至84.8%，容重为120公斤/立方米，孔隙层呈错板条搭接，分布较均匀，磷酸三钙颗粒均匀分散在cs模板上。

所述将改性磷灰石/壳聚糖复合物放置在真空容器中抽真空过程中，使复合生物材料在250℃环境中被抽真空，停止抽真空后，将环境温度降在100℃条件下，向真空容器中注入杀藻剂，把复合生物材料和杀藻剂混合均匀，逐渐降低真空度至常压状态。这是在250℃加温状态下抽真空的方法，目的在于可使复合生物材料中的气体膨胀，加快抽真空的时间，又可在100℃条件下注入小檗碱混均匀后，从100℃温度下降到室温过程中，生物材料的孔隙深处气体收缩产生负压，自动吸入小檗碱颗粒，以便嵌入更多的小檗碱在孔隙深处，提高对小檗碱的缓释效果。

实施例4

试验室实验

将实施例1中组合制剂和空白实验组分别加入铜绿微囊藻培养液和小球藻培养液（初始密度为4×10⁶个/ml），小檗碱终浓度为4mg/l，生长素终浓度为2mg/l。

培养7d铜绿微囊藻和小球藻的生长变化分别见下图1和图2：实验结果表明组合药物能够有效抑杀铜绿微囊藻，6d后铜绿微囊藻全部死亡。组合药物能够显著促进小球藻的生长，与对照组相比，培养7d后小球藻细胞密度提高53%。

组合药物作用24h和48h后铜绿微囊藻和小球藻细胞超微结构变化分别见图3和图4。组合药物作用24h后，铜绿微囊藻胶质鞘部分消失。细胞内类囊体排列紊乱，形态弯曲，散乱。淀粉类物质减少。48h后，细胞形态成圆形或椭圆形，铜绿微囊藻胶质鞘进一步消失，细胞膜形状不明显弯曲凹陷。细胞内仅见少量不明显类囊体杂乱分布，排列不均匀。细胞结构发生明显损伤；与铜绿微囊藻细胞相比，组合药物作用24h和48h后，小球藻细胞形状完整，细胞壁完整厚实，蛋白核被包围在淀粉盘内，叶绿体结构清晰，呈圆弧状。未见细胞结构损伤发生。

实施例5

室外实验

在淡水养殖池塘中构建4个模拟养殖微生态系统：用竹竿扎成“井”字形竹架，然后将白色塑料泡沫绑在竹架上增加其浮力。将体积为150l的白色塑料桶固定在“井”字形竹架上，并盛入养殖池塘水150l。将构建的模拟养殖微生态系统放入养殖池塘内，每个养殖微生态系统分别放入10尾草金鱼。对照组和组合药物试验组每组设2个平行。4d后取水样检测浮游植物及草金鱼死亡情况。

取实施例2中组合制剂对模拟微生态系统浮游植物细胞密度和草金鱼成活率的影响见表1。对照组浮游植物主要包括蓝藻门、绿藻门和硅藻门三大门的13种，其中以蓝藻门的铜绿微囊藻为优势种。组合药物试验组浮游植物主要包括绿藻门、硅藻门和蓝藻门三大门的11种，其中以绿藻门的普通小球藻为优势种。组合药物能够有效抑杀以微囊藻为代表的蓝藻，并显著促进有益浮游绿藻和硅藻的生长，提高养殖对象的成活率。