本发明属于动物繁殖
技术领域：
，特别涉及一种通过添加聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，制备绵羊性控冷冻精液的方法，有效提高绵羊性控冷冻精液活力，从而达到提高受胎的目的、制备家畜性控冷冻精液。
背景技术：
：家畜精子分离-性控技术从2000年产业化以来，目前已经在全世界十余个国家推广应用。目前，牛、猪、鹿等家畜动物性别控制技术都已陆续开发成功，牛的性控冷冻精液也已大规模进行生产并推广应用。而有关绵羊性别控制技术及其应用方面的报道很少，绵羊的性控冷冻精液研究尚处于起步阶段，主要问题集中在精子活力低，直接影响受胎率。聚乙烯吡咯烷酮(pvp)是一种水溶性高分子化合物，具有成膜性、生物相容性、高分子表面活性等性能。据yutaka等人在2000年的研究表明，pvp用于猪精子的稀释液中可延缓精子的运动速度，减小精子的动能损失，从而延长精子的保存时间。由dozortsev在1995年的研究可知，pvp用在精子稀释液中可以形成保护膜，能减少外界环境对精子造成的损害。为了提高绵羊性控冷冻精液解冻后活力以及存活时间，提升绵羊冷冻精液品质，研究开发了添加pvp的绵羊性控冷冻精液的制备方法。技术实现要素：本发明提供了一种利用pvp制备绵羊性控冷冻精液的方法，该技术原理是利用具有成膜性、生物相容性、高分子表面活性等性能，在绵羊精子冷冻的过程中添加pvp，对精子形成保护膜、减缓精子运动，从而提高解冻后精子活力和延长精子存活时间，达到受精受胎的目的。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用pvp制备绵羊性控冷冻精液的方法，其特征在于：它包括以下步骤：1、10％pvp的配置：称取0.5g的pvp加入5ml的蒸馏水，室温溶解，配置成10％pvp浓储液，4度保存1月；2、冷冻液tris-a、tris-b的配置：3、精液检查：①外观评定1)射精量：采精后，将绵羊精液倒入有刻度的离心管中观察即可；2)云雾运动：用肉眼观察新采的公绵羊精液，可以看到由精子活动所引起的翻腾滚动极似云雾状；精子的密度越大，活力越强者，其云雾状越明显；3)色泽：绵羊的正常精液呈乳白色或乳黄色；②活力检测取适量绵羊精液滴在载玻片上，压片后置于显微镜下镜检，活力≥0.6进行分离；4、绵羊精液的抗生素添加与浓度测定①绵羊精液经过步骤3检查完后，取1ml绵羊精液添加0.3mg林可-奇霉素、0.8mg庆大霉素；②将添加好抗生素的绵羊精液用50μm精液过滤器过滤至新的离心管中，过滤后使用密度仪检测原精实际浓度；5、添加pvp性控冷冻精液的制备：①取步骤4测完浓度的绵羊精液染色后上机分离，分离后的精子放入4度室平衡90分钟；②在冷冻液trisa、trisb中添加步骤1配置的10％pvp，使pvp的终浓度为0.5％，添加完pvp后，将trisa、trisb各自混合均匀，放在4℃平衡90分钟；③将步骤①平衡好的精子离心，去掉上清,按照精子终浓度计算所需总体积的一半加入trisa与1/2trisa体积的tris-b，间隔15分钟后,再加入1/2trisa体积的tris-b，每次添加后颠倒轻轻摇匀；④装管和冷冻保存：精子摇匀，按每支250μl，500万精子装管，将冷冻精液摆放到冷冻搓板上，然后放入冷冻仪中，按照冷冻仪操作规程进行冻精操作，最后将冻精投入液氮保存。本发明的优点和有益效果是：在绵羊精子冷冻的过程中添加pvp，对精子形成保护膜、减缓精子运动，提高了解冻后精子活力和延长了精子存活时间，达到受精受胎的目的。具体实施方式实施例：一种利用pvp制备绵羊性控冷冻精液的方法，以绵羊性控冷冻精液为例，它包括以下步骤：1、10％pvp的配置：称取0.5g的pvp加入5ml的蒸馏水，室温溶解配置成10％pvp，4度保存1月，2、冷冻液tris-a、tris-b的配置：3、顶体检测液配制①花生凝集素fitc-pna染液的配置将1mg花生凝集素fitc-pna溶于10mlpbs缓冲液中，然后分装避光保存在-20℃；②pbs缓冲液：nacl8g，kcl0.2g，na2hpo41.15g，kh2po40.2g，用超纯水溶解，定容到1l，将溶液的酸碱度调到ph＝7.4；0.22μm滤器过滤分装，4℃保存备用；③3％pvp:30ml10％pvp加入70ml蒸馏水；4、精液检查：①外观评定1)射精量：采精后，将绵羊精液倒入有刻度的离心管中观察即可；2)云雾运动：用肉眼观察新采的公绵羊精液，可以看到由精子活动所引起的翻腾滚动极似云雾状；精子的密度越大，活力越强者，其云雾状越明显；3)色泽：绵羊的正常精液呈乳白色或乳黄色；②活力检测取适量绵羊精液滴在载玻片上，压片后置于显微镜下镜检，活力≥0.6进行分离；5、绵羊精液的抗生素添加与浓度测定①选取两只杜泊绵羊，精液经过上述步骤4检查完后，1ml绵羊精液添加0.3mg林可-奇霉素、0.8mg庆大霉素；②将添加好抗生素的绵羊精液用50μm精液过滤器过滤至新的离心管中，过滤后使用密度仪检测原精浓度，羊1为14亿/ml，羊2为9.6亿/ml；6、添加pvp性控冷冻精液的制备：①取步骤5测完浓度的绵羊精液染色后上机分离，将两只绵羊精子各分离出总数4亿个精子(机器能显示分离精子数)，分离好的精子放入4度室平衡90分钟；②各取95ml的trisa与trisb，分别添加5ml的10％pvp，使pvp的终浓度为0.5％，添加完后，将trisa、trisb各自混合均匀，放在4℃平衡90分钟；③将步骤①平衡好羊1的4亿精子离心，去掉上清，按照精子终浓度为2000万/ml计算，4亿精子所需加入的冷冻液总体积为20ml，先加入10mltrisa与5mltris-b，混匀，间隔15分钟后，再加入5mltris-b，羊2与羊1操作一样，每次添加后颠倒轻轻摇匀；④装管和冷冻保存，精子摇匀，按每支250μl，500万精子装管，将冷冻精液摆放到冷冻搓板上，然后放入冷冻仪中，按照冷冻仪操作规程进行冻精操作，最后将冻精投入液氮保存；7、冷冻精液各项质量指标检测：(1)精子活力检测预先把载玻片和盖玻片放在37℃加热板上预热10分钟，用移液器离心管取15μl样品滴在载玻片上，压片后置于显微镜下镜检，选择压片均匀的样品区域，一个压片取5个视野，中间1个，四周各取1个，分别计数活精子数和死精子数，并计算活力；活力＝活精子数/活精子数与死精子数的和绵羊1精子活力分组活力未添加组0.25添加pvp组0.45绵羊2精子活力分组活力未添加组0.2添加pvp组0.5(2)冻后精子顶体完整性检测：将解冻后的精液放到含3％等温pvp液的离心管内，800×g离心6min，弃上清液；沉淀精子用37℃的pbs溶液重悬，调整精子密度为1～2×106/ml，移液枪吸取30μl精子悬液，涂片，空气中自然干燥后，用纯甲醇固定10min，再加入30μlfitc-pna染液，37℃、黑暗潮湿环境下孵育30min，之后再用pbs溶液冲洗，空气中自然干燥后，加少许增光剂混匀，盖上盖玻片，无色指甲油封片后，尽快用400×荧光显微镜观察。绵羊1精子顶体完整性检测分组顶体完整率未添加组42％添加pvp组59％绵羊2精子顶体完整性检测分组顶体完整率未添加组43％添加pvp组51％结论：添加pvp后，绵羊性控冷冻精液解冻后活力明显升高，顶体完整率也明显提升。当前第1页12