一种利用液体培养技术提高白菜胚状体直接成苗比率的方法与流程

本发明涉及一种细胞育种技术领域尤其涉及一种利用液体培养技术提高白菜胚状体直接成苗比率的方法。

背景技术：

小孢子培养是对新鲜的游离小孢子给予适当的培养基及培养条件使之发育成胚状体，进而发育成再生植株的技术，可快速得到双单倍体纯系作为亲本。应用于优势杂交育种，缩短育种年限，是一项实用的细胞育种技术。

小孢子培养技术包括小孢子成胚以及胚状体成苗两个过程，成熟的小孢子培养技术应为小孢子成胚率高及胚状体直接成苗率高。小孢子胚状体直接成苗受到很多因素的影响，本领域常规接种胚状体使之成苗采用三角瓶、罐头瓶、组培瓶等容器，培养方式采用固体培养，效率低下，耗费大量的人力和时间，所以建立一种高效的小孢子直接成苗方法至关重要。常规操作步骤是培养基分装到100ml三角瓶中，将再生植株转入培养基后，在温度25±2℃，光照强度3000～4000lx，光周期16h/8h的条件下培养，本发明通过对培养培养方式的具体参数，进而实现高效的胚状体直接成苗的目的。

技术实现要素：

本发明通过一种利用液体培养技术提高白菜胚状体直接成苗比率的方法，需要使用一个特制的液体培养装置。

1)配制液体培养基：此培养基为含蔗糖25～30g/l，6-ba0.2～0.3mg/l，amp0.1～0.15mg/l，ph5.8～6.0的b5培养基，培养基分装量至装置的塑料网平齐处，amp成分采用过滤灭菌，其它成分采用121℃，20min高温湿热灭菌。

2)在无菌操作台中将白菜胚状体转接入装置的塑料网上。

3)培养过程中要向此培养基中进行曝气，每15min进行一次，曝气时间2～3min，确保曝气过程中液面升高程度以不完全淹没胚状体为准。

4)在温度25±3℃，光强度3000～4000lx，光周期16h/8h的条件下培养20～30d后可统计成苗数量，并将苗进行下一步的继代转接。

进一步地，所述液体培养装置为：瓶体为塑料材质，直径7.5cm，高11.0cm，在距离瓶底4.0cm处有4个卡槽，其中嵌入一个多孔的直径为6.0cm的塑料网，瓶盖上有双管孔，一孔为进气端，插入胶管顺培养瓶侧壁至瓶底与曝气环连接，另一端插入除菌空气滤器(与流量计、气泵、继电器相连)；一孔为出气端，插入除菌空气滤器。

进一步地，液体培养装置在使用中同时需要以下配套设备：继电器控制曝气时间、流量计控制曝气量、气泵提供气源。

本发明的有益效果在于：一种利用液体培养技术提高白菜胚状体直接成苗比率的方法，可使胚状体的直接成苗比率为80％～90％，是传统固体培养模式成苗比率的1.5～2.0倍。

附图说明

图1为白菜胚状体不同培养方式直接成苗比率对照表。

图2为不同曝气方式白菜胚状体直接成苗比率对照表。

具体实施方式

1.本发明选择三个不同的白菜品种经小孢子培养产生的胚状体，分别进行固体培养和液体培养，固体培养方式为：选用含蔗糖25～30g/l，6-ba0.2～0.3mg/l，琼脂6.5～7.5g/l，ph5.8～6.0的b5培养基，分装于组培瓶(直径7.5cm，高11cm)中使厚度达到4cm，采用121℃高温湿热灭菌后在无菌操作台中将白菜胚状体转接入组培瓶中培养基表面，在温度25±3℃，光强度3000～4000lx，光周期16h/8h的条件下培养20～30d。液体培养方式为：选用含蔗糖25～30g/l，6-ba0.2～0.3mg/l，amp0.1～0.15mg/l，ph5.8～6.0的b5培养基，分装于组培装置(直径7.5cm，高11cm，距底部4cm处有一塑料网)中使液面达到与塑料网平齐处，amp成分采用过滤灭菌，其它成分采用121℃高温湿热灭菌，在培养过程中同时要向培养基中要进行曝气，每15min进行一次，曝气时间2～3min，并确保曝气过程中液面升高程度以不完全淹没胚状体为准，将白菜胚状体转接入塑料网上，在温度25±3℃，光强度3000～4000lx，光周期16h/8h的条件下培养20～30d。

将胚状体按上述两种不同培养方式各分为40瓶进行，在培养20～30d后分别对胚状体数，再生植株数，直接成苗比率进行统计与计算，见附图1中可以看出，利用液体培养技术可以大幅度提高白菜胚状体直接成苗比率，可使胚状体的直接成苗比率为80％～90％，是固体培养模式的1.5～2.0倍。

2.选择三个不同的白菜品种经小孢子培养产生的胚状体进行液体培养：选用含蔗糖25～30g/l，6-ba0.2～0.3mg/l，amp0.1～0.15mg/l，ph5.8～6.0的b5培养基，分装于组培装置(直径7.5cm，高11cm，距底部4cm处有一塑料网)中使液面达到与塑料网平齐处，amp成分采用过滤灭菌，其它成分采用121℃高温湿热灭菌，在培养过程中同时要向培养基中要进行曝气，曝气方式分为四种：

a.每15min进行一次，曝气时间2～3min，并确保曝气过程中液面升高程度以不完全淹没胚状体为准；

b.每8min进行一次，曝气时间2～3min，并确保曝气过程中液面升高程度以不完全淹没胚状体为准；

c.每30min进行一次，曝气时间2～3min，并确保曝气过程中液面升高程度以不完全淹没胚状体为准；

d.每15min进行一次，曝气时间1～2min，并确保曝气过程中液面升高程度以不完全淹没胚状体为准；

将白菜胚状体转接入塑料网上，在温度25±3℃，光强度3000～4000lx，光周期16h/8h的条件下培养20～30d。将直接成苗比率进行计算，见附图2，a的效率为最优。

利用本发明所述的技术方案，或本领域的技术人员在本发明技术方案的启发下，设计出类似的技术方案，而达到上述技术效果的，均是落入本发明的保护范围。

技术特征：

技术总结
本发明提供了一种利用液体培养技术提高白菜胚状体直接成苗比率的方法，本方法使用了一个特制的适用于液体培养基的装置，所用培养基为含蔗糖25～30g/L，6‑BA 0.2～0.3mg/L，氨苄青霉素(Amp)0.1～0.15mg/L，pH 5.8～6.0的B5培养基，在培养过程中要向此培养基中进行曝气，每15min进行一次，曝气时间2～3min，确保曝气过程中液面升高程度以不完全淹没胚状体为准，在温度25±3℃，光强度3000～4000lx，光周期16h/8h的条件下培养20～30d后可统计成苗的数量，并将苗进行下一步地继代转接。通过统计与计算，以此方法培养可使胚状体的直接成苗比率为80％～90％，是传统培养模式成苗比率的1.5～2.0倍。

技术研发人员：戴速航
受保护的技术使用者：沈阳静冶生物科技有限公司
技术研发日：2017.11.09
技术公布日：2018.04.20