一种非酒精性慢性脂肪性肝炎非人灵长类动物模型及其构建方法和用途与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种非酒精性慢性脂肪性肝炎（nash）以及发展成慢性肝纤维化，肝硬化的非人灵长类动物模型的构建方法及其用途。

背景技术：

非酒精性脂肪性肝炎(nash)是非酒精性脂肪性肝病(nafld)预后较差的一个阶段,可发展为肝硬化甚至肝细胞癌,发病率呈逐年上升趋势,目前尚无明显有效的治疗方法。动物模型在探索疾病的发病机制、评价诊断方法、筛选防治药物等领域均有重要作用。近年来,许多学者利用实验动物复制非酒精性脂肪性肝炎病理模型并对其进行了大量的研究。目前国内外常用的非酒精性脂肪性肝炎动物模型,包括营养失调性、药物中毒性、特殊品系及复合因素诱导的脂肪肝模型。营养失调性脂肪肝动物模型是国内外最常用的非酒精性脂肪性肝炎动物模型,包括高脂饮食脂肪肝动物模型、高糖饮食脂肪肝动物模型和胆碱-蛋氨酸缺乏脂肪肝动物模型。该类模型稳定性好,可重复性高，方法简便,病死率低，病变有渐进性过程，造模停止后逆转缓慢,便于药物干预。

例如cn201310452707.1公开了一种复合高脂饲料在构建非酒精性脂肪肝大鼠模型中的应用。cn201710468378.8公开了一种由高脂高糖饮食致大鼠肥胖诱导非酒精性脂肪肝的模型建立方法。cn201610188042.1公开了一种非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立方法。cn201210533667.9公开了一种非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法。但是由于所用饲料组成与非酒精性脂肪性肝炎临床患者的实际饮食情况(以糖类为主)不同，现有的小鼠或大鼠nash，肝纤维化，肝硬化以及肝癌模型与人类疾病存在着巨大的差异，包括脂肪变性和脂肪型肝炎的差异和不一致性，即小动物模型的炎症常常在早期脂肪变的同时就出现炎症，这点与人类疾病相差甚远。特别是在疾病免疫学反应方面差距更大。最接近人类免疫系统的动物是非人灵长类动物。对于大分子免疫治疗药物的开发，理性的动物模型只有在非人灵长类动物，猴子上建立才能够反映人类非酒精性脂肪性肝炎的病因、疾病进展和病理学特征，以及临床药物开发。

然而迄今为止,尚无理想的非人灵长类动物nash模型。较为常见的有非人灵长类动物的脂肪肝模型，和单纯的化学诱导（ccl4）的肝纤维化模型。这些模型都不能够准确的反映出nash的真实病理进程和临床病症和转归，模型很少或仅部分重现了人类非酒精性脂肪性肝炎的病理特征的某一部分，而很多重要的疾病如胰岛素抵抗和纤维化均没有再现。同时，基于生物大分子药物的开发，对于新的非酒精性脂肪性肝炎需求与日俱增。

技术实现要素：

本发明针对现有技术不足，提供了一种模拟人类非酒精性脂肪性肝炎（nash）的非人灵长类动物模型及其构建方法及用途，该模型可进一步伴随有慢性肝纤维化和肝硬化的病理特征。本发明所述方法能够再现模型动物的糖尿病基本病症（血糖升高），重度脂肪肝伴有脂肪性肝炎和肝纤维化，使得人类nash的基本病理特征集中呈现在一个动物模型上，为更好的研发nash以及新药开发，特别是大分子药物的开发提供了可靠的模型保证。

本发明具体技术方案如下：

一种非酒精性慢性脂肪性肝炎非人灵长类动物模型的构建方法，包括如下步骤：

（1）向成年非人灵长类动物提供高脂饲料，同时提供动物酒精饮水,饲养1-12个月；

（2）给予动物四氯化碳1-16周，同时继续给予高脂饲养和酒精饮水，构建非酒精性慢性脂肪性肝炎非人灵长类动物模型。

所述非人灵长类动物包括但不限于雌性或雄性的食蟹猴和猕猴等非人灵长类实验动物。

所述高脂饲料的脂肪含量为30-60kcal%，但不限于此含量。

所述酒精饮水的酒精浓度优选5-20%，更优选10%（v/v）。

优选的，步骤（1）高脂饲料+酒精饮水投喂周期为4-6个月。

优选的，步骤（2）给予动物四氯化碳的剂量为0.5-1.5ml/kg，更优选1ml/kg。优选ccl4：食用橄榄油为1：1（体积比）。

优选的，步骤（2）给予动物四氯化碳的途径包括但不限于口服。依据实验要求其投与途径还包括皮下注射和腹腔注射两种途径。

优选的，步骤（2）给予动物四氯化碳4-10周。

本发明的另一目的在于提供一种非酒精性慢性脂肪性肝炎非人灵长类动物模型采用本发明所述方法构建而成，本发明所述的模型可伴有慢性肝纤维化和早期肝硬化的病理特征。

本发明的另一目的在于提供一种本发明所述非酒精性慢性脂肪性肝炎非人灵长类动物模型在筛选预防或治疗非酒精性慢性脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化或肝癌的药物中的应用以及作为动物模型在慢性脂肪肝，脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化，肝细胞性肝癌，代谢性疾病，糖尿病，糖尿病并发症的研究中的应用。

本发明优点：本发明采用高脂饲料+酒精饮水饲育，并在一定时期给与肝脏二次打击诱导nash，符合目前人类nash和肝纤维化的发病基本病理过程。能真实模拟人类nash的病理过程。模型成功率百分之百，稳定性好，死亡率低。填补了该领域非人灵长类动物模型的空白，为人类nash和肝纤维化的研究，特别是大分子抗体药物的新药研发提供了必不可少的动物模型，使得nash大分子药物临床前研发成为可能。本发明所述方法简单易行，能广泛推广，可真实模拟nash以及nash转化成肝纤维化以及肝硬化的病理发生过程。因其病理过程与人nash，肝纤维化以及肝硬化病理过程高度相似，具备非常高的病因学和病理学研究价值，在对药物的评价中具有重要意义。

附图说明

图1为单纯ccl4诱导肝纤维化的肝组织病理变化h&e染色结果。（a：正常肝脏，b：ccl42周，c：ccl46周）。

图2为单纯ccl4诱导肝纤维化的肝组织病理变化天狼星红染色结果。（d：正常肝脏，e：ccl42周，f：ccl46周）。

图3为单纯ccl4诱导肝纤维化的动物血清学alt和ast变化。

图4为高脂饲料+酒精饮水饲养5个月后动物肝脏大体图。(g&h：正常肝脏，i&j：高脂+酒精5个月后的脂肪肝)。

图5为高脂饲料+酒精饮水饲养5个月后动物肝脏he染色组织学图。（k：正常肝脏，l：高脂+酒精2个月，m：高脂+酒精5个月）

图6为高脂饲料+酒精饮水饲养5个月后动物血清学alt和ast变化。

图7为高脂饲料+酒精饮水饲养5个月加ccl4二次打击第一周后动物血清学alt和ast变化。

图8为高脂饲料+酒精饮水饲养5个月+ccl4二次打击第二周、第四周和第六周肝脏组织学变化h&e染色结果。（n：ccl4-2周，o：ccl4-4周，p：ccl4-6周）。

图9为高脂饲料+酒精饮水饲养5个月+ccl4二次打击第二周、第四周和第六周肝脏组织学变化，massontrichrome染色结果。（q：ccl4-2周，r：ccl4-4周，s：ccl4-6周）。

图10为高脂饲料+酒精饮水饲养5个月+ccl4二次打击第二周、第四周和第六周肝脏组织学变化，天狼星红染色结果。（t：ccl4-2周，u：ccl4-4周，v：ccl4-6周）。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例以成年食蟹猴为例，制备非酒精性脂肪性肝炎（nash）及进一步伴有慢性肝纤维化和早期肝硬化病理特征的动物模型。

本实验选用15只4-6岁成年食蟹猴，体重3.8～4.0kg。

实验分组：

单纯ccl4诱导的肝纤维化模型组5只，给予正常饲料饲养，口服ccl4（1ml/kg，ccl4：橄榄油=1:1），每周三次，共6周；

高脂+酒精+ccl4诱导的nash模型组10只，动物首先给予高脂饲料（脂肪40%）+低浓度酒精（10%）饮水特殊饲养5个月后，随机选择5只进行肝功能和肝脏病理检测，其余5只继续给予高脂饲养和酒精饮水，口服ccl4（1ml/kg，ccl4：橄榄油=1:1）二次打击，每周三次，共6周。

对上述动物定期进行动物肝功能检测（alt，ast）用于监测肝纤维化和nash的临床进程；定期的动物肝脏活检病理检测判定nash的不同病理变化时期包括，脂肪肝期，脂肪性肝炎期，脂肪性肝炎伴随肝纤维化期的病理过程。

实验结果

图1-3为单纯ccl4诱导肝纤维化模型组的肝功能和肝脏活检病理研究结果。研究结果表明，单纯ccl4在不同时期仅仅诱导肝细胞损伤包括变性，坏死和炎细胞浸润（图1），伴有显著性肝纤维化（图2），同时伴有alt，ast的升高（图3）。但是，动物没有脂肪变和重度脂肪肝，符合化学诱导的肝纤维化病理变化。

图4-6为高脂+酒精5个月模型组的肝功能和肝脏活检病理研究结果。研究结果表明，高脂饲料（脂肪40%）+低浓度酒精（10%）饮水特殊饲养5个月后动物表现为重度脂肪肝（图4），但是无炎症反应和纤维化病理改变（图5），也无肝脏功能的酶学改变，即alt，ast维持在正常范围（图6）。

上述结果表明单纯的ccl4诱导的肝纤维化仅仅是损伤性肝纤维化，并非nash的肝纤维化。单纯给予高脂+酒精仅仅诱导出脂肪肝，不具备nash的病理改变。

图7-10为高脂饲料+酒精饮水饲养5个月+ccl4二次打击的模型组的肝功能和肝脏活检病理研究结果。研究结果表明，ccl4二次打击后出现显著性肝功能损伤，表现为alt和ast显著性升高（图7）。随着ccl4的连续给予，肝脏逐渐出现纤维化，至ccl4六周可见重度脂肪肝，炎细胞浸润（图8）以及显著性肝纤维化和早期肝硬化（图9）。其纤维化特征为肝细胞索之间的纤维化（图10），完全符合人类nash的肝纤维化特征。

本发明采用高脂饲料+酒精饮水饲育，并在一定时期给与肝脏二次打击诱导nash，符合目前人类nash和肝纤维化的发病基本理念。能真实模拟人类nash的病理过程。模型成功率百分之百，稳定性好，死亡率低。填补了该领域非人灵长类动物模型的空白，为人类nash和肝纤维化的研究，特别是新药研发提供了不可缺少的动物模型。