本发明涉及一种烟草外植体防褐化方法，具体是一种多物质组合的烟草外植体防褐化方法，属于植物组织培养领域。
背景技术：
褐化是指外植体在诱导脱分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质，以至培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐化的发生是由于组织中多酚氧化酶被激活，酚类化合物被氧化形成褐色的醌类物质。醌类化合物在酪氨酸酶的作用下，与培养材料组织中的蛋白质发生聚合，与培养材料组织中的蛋白质发生聚合引起其他酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。
对于引起植物组织褐化的因素已有研究报道，引起组织培养中外植体褐化的主要因素是受植物的基因型、外植体影响、培养条件及培养基等影响。由于褐化对于外植体材料产生的毒害作用，将进一步影响植物材料的生长和分化，严重时导致死亡。尽管引起褐化现象的因素较多，但选择合适的外植体，筛选合适的培养基和培养条件能有效地防止褐化。
烟草（nicotianatabacum）是茄科烟草属植物，现主要分布在南美洲、南亚和中国等地区。它不仅是重要的经济作物，更是国家和地方财税的重要经济来源。烟草有多种用途，可用于医药等领域，有研究者在花烟草中发现一种能够杀死癌细胞的新蛋白质化合物。但是烟草在组织培养过程中的褐化问题是多发的常见的，几乎不可避免，褐化会导致植株的死亡，也就是培养基中的植物不能继续进行培养，所以防止褐化是在烟草组织培养中要极力解决的问题。
目前有使用防褐剂的相关研究，然而，防褐剂并非越多效果越好，不同种类和数量的防褐剂组合不恰当反而会影响植物本身生长，而且其他用途的物质加入可能会有难以预料的效果，值得探索。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供基于多物质组合的烟草外植体防褐化方法。
本发明采用解决技术问题方案如下：
一种多物质组合的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：
步骤（1），种子的消毒；
步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到ms培养基中培养，种子发芽长成幼苗；种子的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d；
步骤（3），烟草外植体培养：将步骤（2）中得到的幼苗，利用打孔器进行打孔得到烟草叶盘，将叶盘置于ms分化培养基中培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养5d，得到外植体；所述叶盘ms分化培养基为ms基本培养基中添加0.5mg/l的萘乙酸naa、2mg/l的6-苄基腺嘌呤6-ba、30g/l蔗糖，4g/l的琼脂，培养基的ph值为5.7；
步骤（4），防褐化培养：将步骤（3）中得到的外植体置于ms防褐化培养基中，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，ms防褐化培养基为ms基本培养基中添加5-12.5g/l氯化钙，2.5-7.5g/ld-异抗坏血酸钠，1-4g/l柠檬酸、30g/l蔗糖和4g/l的琼脂，培养基的ph值为5-6。
进一步地，步骤（1）中，种子消毒的具体步骤为：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％agno3消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。
进一步地，步骤（2）中，ms培养基为ms基本培养基中添加30g/l蔗糖和4g/l的琼脂，培养基的ph值为5.7。
进一步地，步骤（4）中，ms防褐化培养基的制备方法如下：
a、d-异抗坏血酸钠的制备：称取d-异抗坏血酸钠溶于无菌水中，在超净工作台中使用滤头过滤灭菌，制成浓度为50g/l的溶液；
b、柠檬酸的制备：称取柠檬酸溶于无菌水中，在超净工作台中使用滤头过滤灭菌，制成浓度为40g/l的溶液；
c、配制1lms防褐化培养基：将ms基本培养基4.43g，30g蔗糖和1l超纯水混合，并调节培养基的ph值为5.7；
d、防褐化培养基中添加防褐添加剂5-12.5g/l氯化钙，4g琼脂，121℃灭菌15min；
e、灭菌后，添加2.5-7.5g/ld-异抗坏血酸钠，1-4g/l柠檬酸，摇匀，即得到ms防褐化培养基。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明添加d-异抗坏血酸钠、柠檬酸和氯化钙在培养基中，d-异抗坏血酸钠具有防褐化的作用，且成本较低，柠檬酸对于ppo的辅基铜离子有螯合作用，从而能有效抑制ppo的活性，来改善褐化现象。而氯化钙在一定浓度时能有效抑制酶活性的作用。同时添加这三种成分对缓解外植体褐化的现象，无需辅助其他防褐化手段。
柠檬酸作为常用防褐剂，与抗坏血酸相比，d-异抗坏血酸钠也具有防褐化作用，且价格更低廉，氯化钙不常作为防褐剂，然而，三种物质组合使用却可以有效缓解外植体的褐化现象。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例的基于d-异抗坏血酸钠、柠檬酸和氯化钙组合的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：
步骤（1），种子的消毒：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％agno3消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。
步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到ms培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d，种子发芽长成幼苗，所述种子ms培养基为ms基本培养基中添加30g/l蔗糖和4g/l的琼脂，培养基的ph值为5.7；
步骤（3），烟草外植体培养：将步骤（2）中得到的幼苗，利用打孔器进行打孔得到烟草叶盘，将叶盘置于ms分化培养基中培养，28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养5d，得到外植体，所述叶盘ms分化培养基为ms基本培养基中添加0.5mg/l的萘乙酸naa、2mg/l的6-苄基腺嘌呤6-ba、30g/l蔗糖和4g/l的琼脂，培养基的ph值为5.7；
步骤（4），防褐化培养：将步骤(3)中得到的外植体置于ms防褐化培养基中，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，ms防褐化培养基为ms基本培养基中加入10g/l氯化钙、5g/ld-异抗坏血酸钠、2g/l柠檬酸，30g/l蔗糖，4g/l的琼脂，培养基的ph值为5.7；
ms防褐化培养基的制备方法如下：
a、d-异抗坏血酸钠的制备：称取5gd-异抗坏血酸钠溶于100ml无菌水中，在超净工作台中使用0.22μm滤头过滤灭菌，制成浓度为50g/l的溶液。
b、柠檬酸的制备：称取4gd-异抗坏血酸钠溶于100ml无菌水中，在超净工作台中使用0.22μm滤头过滤灭菌，制成浓度为40g/l的溶液。
c、配制1lms防褐化培养基：将ms基本培养基4.43g、30g蔗糖和1l超纯水混合，并调节培养基的ph值为5.7；
d、防褐化培养基中添加防褐添加剂10g氯化钙和4g琼脂，121℃灭菌15min；
e、灭菌后，添加5g/ld-异抗坏血酸钠和2g/l柠檬酸，摇匀倒培养基，1l的ms防褐化培养基约可倒100mm培养皿30个，150mm培养皿10个，300ml培养瓶15个。
本实施例中，外植体褐化率为16.3％。
实施例2
本实施例的基于d-异抗坏血酸钠、柠檬酸和氯化钙组合的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：
步骤（1）-（3）与实施例1相同。
步骤（4），防褐化培养：将步骤(3)中得到的外植体置于ms防褐化培养基中，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，ms防褐化培养基为ms基本培养基中加入2.5g/ld-异抗坏血酸钠、1g/l柠檬酸、5g/l氯化钙、30g/l蔗糖和4g/l的琼脂，培养基的ph值为5.7；
ms防褐化培养基的制备方法如下：
a、d-异抗坏血酸钠的制备：称取5gd-异抗坏血酸钠溶于100ml无菌水中，在超净工作台中使用0.22μm滤头过滤灭菌，制成浓度为50g/l的溶液。
b、柠檬酸的制备：称取4gd-异抗坏血酸钠溶于100ml无菌水中，在超净工作台中使用0.22μm滤头过滤灭菌，制成浓度为40g/l的溶液。
c、配制1lms防褐化培养基：将ms基本培养基4.43g、30g蔗糖和1l超纯水混合，并调节培养基的ph值为5.7；
d、防褐化培养基中添加防褐添加剂5g氯化钙和4g琼脂，121℃灭菌15min；
e、灭菌后，添加2.5g/ld-异抗坏血酸钠和1g/l柠檬酸，摇匀倒培养基，1l的ms防褐化培养基约可倒100mm培养皿30个，150mm培养皿10个，300ml培养瓶15个。
本实施例中，外植体褐化率为23.5％。
实施例3
本实施例的基于d-异抗坏血酸钠、柠檬酸和氯化钙组合的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：
步骤（1）-（3）与实施例1相同；
步骤（4），防褐化培养：将步骤（3）中得到的外植体置于ms防褐化培养基中，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，ms防褐化培养基为ms基本培养基中加入防褐添加剂7.5g/ld-异抗坏血酸钠、4g/l柠檬酸、12.5g/l氯化钙、30g/l蔗糖和4g/l的琼脂，培养基的ph值为5.7；
ms防褐化培养基的制备方法如下：
a、d-异抗坏血酸钠的制备：称取5gd-异抗坏血酸钠溶于100ml无菌水中，在超净工作台中使用0.22μm滤头过滤灭菌，制成浓度为50g/l的溶液。
b、柠檬酸的制备：称取4gd-异抗坏血酸钠溶于100ml无菌水中，在超净工作台中使用0.22μm滤头过滤灭菌，制成浓度为40g/l的溶液。
c、配制1lms防褐化培养基：将ms基本培养基4.43g、30g蔗糖和1l超纯水混合，并调节培养基的ph值为5.7；
d、防褐化培养基中添加防褐添加剂12.5g/l氯化钙和4g琼脂，121℃灭菌15min；
e、灭菌后，添加7.5g/ld-异抗坏血酸钠和4g/l柠檬酸，摇匀倒培养基，1l的ms防褐化培养基约可倒100mm培养皿30个，150mm培养皿10个，300ml培养瓶15个。
本实施例中，外植体褐化率为18.4％。
对照实验：
对照为不添加氯化钙、d-异抗坏血酸钠和柠檬酸，仅添加5g/ld-异抗坏血酸钠、2g/l柠檬酸，其余与实施例1方法相同，结果如表1所示：
表1对照与实施例1-3的效果对比
由表1可以看出，添加d-异抗坏血酸钠、柠檬酸和氯化钙共同作用的防褐化效果显著，柠檬酸作为常用防褐剂，d-异抗坏血酸钠也具有防褐化作用，然而，仅仅添加这两种褐化剂效果并不显著，甚至还低于单独的褐化剂作用，加入氯化钙后，与工艺配合，效果显著，这三者组合的效果是没有预料到的，有巨大的开发潜力。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。