一种铁皮石斛原球茎快速增殖固液混合培养方法与流程

本发明属于铁皮石斛组织培养技术领域，具体涉及一种铁皮石斛原球茎快速增殖固液混合培养方法。

背景技术：

铁皮石斛是一种传统的名贵中药材(dendrobiumofficinalekimuraetmigo)，又名：黑节草、云南铁皮。属微子目，兰科多年生附生草本植物。茎直立，圆柱形，长9-35厘米，粗2-4毫米，萼片和花瓣呈黄绿色，近相似，长圆状披针形，长约1.8cm，宽4-5mm，花期3-6月。主要分布于中国安微、浙江、福建、云南等地。其茎入药，味甘，性微寒，属补益药中的补阴药，益胃生津，滋阴清热，明目强腰。其药理作用主要表现为促进腺体分泌和脏器运动，具有降血糖作用。铁皮石斛颗粒(tpsh)可促进荷瘤动物巨噬细胞的吞噬功能，增强t淋巴细胞的增殖、分化及nk细胞的活性，并能明显提高荷瘤动物的血清溶血素值，tpsh无论是对非特异性免疫功能，还是特异性细胞免疫、体液免疫功能，均有一定的提高作用。然而传统的用药方式都是直接采集野生的铁皮石斛，由于铁皮石斛在自然条件下繁殖率极低，虽然其成熟的每个荚果中含上万、上十万粒的种子，但因为种子太过于细小，其中没有足够的营养成分供其萌发生长，所以相对而言，铁皮石斛自然条件下繁殖系数很低，再加上铁皮石斛生长周期较长，一般需要两到三年的生长周期才可以取来用药。数据显示铁皮石斛的市场需求量连年持续增长，对于野生资源的过度采撷和破坏导致野生铁皮石斛濒临灭绝。

综上所述，铁皮石斛具有很大的药用价值。但由于铁皮石斛自然条件下繁殖系数很低，再加上铁皮石斛生长周期较长以及对于野生资源的过度采撷和破坏导致野生铁皮石斛濒临灭绝。这些弊端使铁皮石斛产业化到很大限制，不能满足日渐增长的市场需求。

技术实现要素：

为了解决铁皮石斛供不应求的问题并缓解环境压力，本发明利用植物组织培育铁皮石斛原球茎，使其大规模工业化生产以替代铁皮石斛药材，具体技术方案如下：一种铁皮石斛原球茎快速增殖固液混合培养方法，以铁皮石斛外表刚转为褐色的蒴果为外植体，固体培养基上进行培养得到原球茎，再将原球茎放入液体培养基进行快速增殖；

具体步骤如下：

(1)外植体的消毒

以铁皮石斛外表刚转为褐色的蒴果为外植体，将外植体在固体培养基上培养得到原球茎，再将原球茎放入液体培养基进行快速增殖；

具体步骤如下：

(1)外植体的消毒

取铁皮石斛外表刚转为褐色的蒴果，进行无菌化处理，以无菌铁皮石斛蒴果为外植体备用；

所述的无菌处理步骤为：用清洁粉浸泡铁皮石斛蒴果3min，然后捞出用自来水冲洗干净，在无菌条件下用70vt％酒精表面消毒1.5min，无菌水清洗1分钟，再用2wt％的次氯酸钠溶液浸泡10-15min，最后用无菌水清洗4-5次，每次清洗1min，冲洗结束后用灭菌滤纸吸去铁皮石斛蒴果表面的水分；

(2)铁皮石斛原球茎固体培养基培养

将步骤(1)所得的外植体接种于固体培养基上，控制温度为18-22℃，培养30天，蒴果开始萌发变绿，即为铁皮石斛原球茎；

(3)铁皮石斛原球茎液体增殖培养基培养

将步骤(2)所得的铁皮石斛原球茎中加入液体培养基进行快速增殖。

进一步的，所述的固体培养基以每升计量包括如下成分：所述的固体培养基以每升计量包括如下成分：1896mgkno3、7.5mgmnso4·h2o、125mgcacl2·2h2o、28mgna2edta·2h2o、0.187mgcocl2·6h2o、0.18mgcuso4·5h2o、101mg(nh4)2so4、2mgznso4·7h2o、0.2mg萘乙酸、22.8mgfeso4·7h2o、14mgvb1、0.4mgnamoo4·2h2o、3.8mg吲哚-3-乙酸、3.5mgh3bo3、1.0mg烟酸、120mgnah2po4·h2o、1.3mgki、310mgvc、360mgmgso4·7h2o、1.85mgvb6、288.56mg肌醇、5mg-6mg吲哚乙酸、0.6mg-1.2mg6-苄氨基腺嘌呤、25g-35g蔗糖、6g-7.5g琼脂、0.5mg-1.2mg水解乳蛋白、3g-5g活性炭、余量为水。

更进一步的，所述的固体培养基以每升计量包括如下成分：1896mgkno3、7.5mgmnso4·h2o、125mgcacl2·2h2o、28mgna2edta·2h2o、0.187mgcocl2·6h2o、0.18mgcuso4·5h2o、101mg(nh4)2so4、2mgznso4·7h2o、0.2mg萘乙酸、22.8mgfeso4·7h2o、14mgvb1、0.4mgnamoo4·2h2o、3.8mg吲哚-3-乙酸、3.5mgh3bo3、1.0mg烟酸、120mgnah2po4·h2o、1.3mgki、310mgvc、360mgmgso4·7h2o、1.85mgvb6、288.56mg肌醇、5mg吲哚乙酸、0.6mg6-苄氨基腺嘌呤、25g蔗糖、6g琼脂、0.5mg水解乳蛋白、3g活性炭、余量为水。

进一步的，所述的液体培养基以每升计量包括如下成分：1896mgkno3、7.5mgmnso4·h2o、125mgcacl2·2h2o、28mgna2edta·2h2o、0.187mgcocl2·6h2o、0.18mgcuso4·5h2o、101mg(nh4)2so4、2mgznso4·7h2o、22.8mgfeso4·7h2o、14mgvb1、0.4mgnamoo4·2h2o、3.5mgh3bo3、1.0mg烟酸、120mgnah2po4·h2o、310mgvc、360mgmgso4·7h2o、1.85mgvb6、288.56mg肌醇、0.6mg-1.2mg6-ba、0.2mg-0.6mgnaa、25g-35g蔗糖、0.5mg-1.2mg水解乳蛋白、10g-30g香蕉泥、15g-30g土豆泥、余量为水。

进一步的，所述的液体培养基以每升计量包括如下成分：1896mgkno3、7.5mgmnso4·h2o、125mgcacl2·2h2o、28mgna2edta·2h2o、0.187mgcocl2·6h2o、0.18mgcuso4·5h2o、101mg(nh4)2so4、2mgznso4·7h2o、22.8mgfeso4·7h2o、14mgvb1、0.4mgnamoo4·2h2o、3.5mgh3bo3、1.0mg烟酸、120mgnah2po4·h2o、310mgvc、360mgmgso4·7h2o、1.85mgvb6、288.56mg肌醇、0.6mg6-ba、0.2mgnaa、25g蔗糖、0.5mg水解乳蛋白、10g香蕉泥、15g土豆泥、余量为水。

所述的水解乳蛋白为本领域的常规试剂，市售可得；所述土豆汁由土豆削皮榨汁得到，香蕉泥为去皮香蕉捣碎得到。

原球茎(protocorm)是铁皮石斛种子萌发过程中，原胚萌动膨大，突破种皮后形成的浅黄色小圆锥形胚性组织。铁皮石斛的外植体叶尖、茎尖、基尖等经过诱导也可以形成类似于原球茎的胚性组织。原球茎可以进一步发育成为假鳞茎，然后长出根和叶，形成完整的植株。但原球茎形成成熟植株受很多因素限制，所需时间也比较长。铁皮石斛的原球茎生长快速，自我分生旺盛，活力持久，是一种理想的铁皮石斛药材替代品。

因此本发明的铁皮石斛原球茎快速增殖固液混合培养方法不仅可以简便快捷的得到铁皮石斛原球茎，而且解决了以往单纯固体培养基原球茎增殖速度慢、转接繁杂费时费力效率低等问题，本发明提供了一种运用植物组织培养技术使铁皮石斛原球茎快速增殖方法，为铁皮石斛原球茎可大规模工业化生产替代铁皮石斛药材提供了最佳途径。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明以野生铁皮石斛蒴果为外植体，采用本发明所特有的固、液混合培养基，一步得到铁皮石斛原球茎，收率达到100％，生长速率1.0g/l·d，30d便可长出状态良好的浅绿色带点微黄的原球茎，置于液体培养基后可以不断增殖，并且解决了转接繁杂、费时、费力效率低等问题；

(2)采用本发明所述方法能最大程度实现铁皮石斛原球茎快速增殖，在操作无失误的情况下，能每月增殖20倍，解决了本领域技术人员亟待解决的增殖速度慢的问题；

(3)本发明提供的培养方法具有简单、铁皮石斛生长状态好、原球茎增殖所需时间短、速度快、可持续生长等特点，便于大规模液体培养铁皮石斛原球茎，解决了铁皮石斛药用资源紧缺的问题。

附图说明

图1是铁皮石斛蒴果外植体诱导出来的原球茎图；

图2是铁皮石斛原球茎在固体培养基中的初期生长情况图；

图3是铁皮石斛原球茎加入液体培养基后的快速增殖情况图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详述。以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。本发明所应用的化学试剂以及仪器如未经特别说明，均可从商业渠道购买。

实施例1

铁皮石斛原球茎快速增殖固液混合培养方法，具体步骤如下：

(1)外植体的消毒

取铁皮石斛外表刚转为褐色的蒴果，进行无菌化处理，获得无菌铁皮石斛蒴果为外植体备用：

所述的无菌处理步骤为：用清洁粉浸泡铁皮石斛蒴果3min，然后捞出用自来水冲洗干净，在无菌条件下用70vt％酒精表面消毒1.5min，无菌水清洗1分钟，再用2wt％的次氯酸钠溶液浸泡10min，最后用无菌水清洗4次，每次清洗1min，冲洗结束后用灭菌滤纸吸去铁皮石斛蒴果表面的水分；

(2)铁皮石斛原球茎固体培养基培养

将步骤(1)所得的消毒外植体接种于固体培养基上，控制温度为18℃，培养30天，蒴果开始萌发变绿；所述固体培养基(1l)的配方如下：1896mgkno3、7.5mgmnso4·h2o、125mgcacl2·2h2o、28mgna2edta·2h2o、0.187mgcocl2·6h2o、0.18mgcuso4·5h2o、101mg(nh4)2so4、2mgznso4·7h2o、0.2mgnaa、22.8mgfeso4·7h2o、14mgvb1、0.4mgnamoo4·2h2o、3.8mgiaa、3.5mgh3bo3、1.0mg烟酸、120mgnah2po4·h2o、1.3mgki、310mgvc、360mgmgso4·7h2o、1.85mgvb6、288.56mg肌醇、5mgiba、0.6mg6-ba、25g蔗糖、6g琼脂、0.5mg水解乳蛋白、3g活性炭和余量的水。

(3)原球茎液体增殖培养基培养

将步骤(2)所得的铁皮石斛原球茎中加入液体培养基进行铁皮石斛原球茎快速增殖；所述液体培养基(1l)的配方如下：1896mgkno3、7.5mgmnso4·h2o、125mgcacl2·2h2o、28mgna2edta·2h2o、0.187mgcocl2·6h2o、0.18mgcuso4·5h2o、101mg(nh4)2so4、2mgznso4·7h2o、22.8mgfeso4·7h2o、14mgvb1、0.4mgnamoo4·2h2o、3.5mgh3bo3、1.0mg烟酸、120mgnah2po4·h2o、310mgvc、360mgmgso4·7h2o、1.85mgvb6、288.56mg肌醇、0.6mg6-ba、0.2mgnaa、25g蔗糖、0.5mg水解乳蛋白、10g香蕉泥、15g土豆泥和余量的水。

实施例2

铁皮石斛原球茎快速增殖固液混合培养方法，具体步骤如下：

(1)外植体的消毒

取铁皮石斛外表刚转为褐色的蒴果，进行无菌化处理，获得无菌铁皮石斛蒴果为外植体备用：

所述的无菌处理步骤为：用清洁粉浸泡铁皮石斛蒴果3min，然后捞出用自来水冲洗干净，在无菌条件下用70vt％酒精表面消毒1.5min，无菌水清洗1分钟，再用2wt％的次氯酸钠溶液浸泡10min，最后用无菌水清洗5次，每次清洗1min，冲洗结束后用灭菌滤纸吸去铁皮石斛蒴果表面的水分；

(2)铁皮石斛原球茎固体培养基培养

将步骤(1)所得的消毒外植体接种于固体培养基上，控制温度为18℃，培养30天，蒴果开始萌发变绿；所述固体培养基(1l)的配方如下：1896mgkno3、7.5mgmnso4·h2o、125mgcacl2·2h2o、28mgna2edta·2h2o、0.187mgcocl2·6h2o、0.18mgcuso4·5h2o、101mg(nh4)2so4、2mgznso4·7h2o、0.6mgnaa、22.8mgfeso4·7h2o、14mgvb1、0.4mgnamoo4·2h2o、3.8mgiaa、3.5mgh3bo3、1.0mg烟酸、120mgnah2po4·h2o、1.3mgki、310mgvc、360mgmgso4·7h2o、1.85mgvb6、288.56mg肌醇、6mgiba、1.2mg6-ba、35g蔗糖、7.5g琼脂、1.2mg水解乳蛋白、5g活性炭、余量的水。

(3)原球茎液体增殖培养基培养

将步骤(2)所得的铁皮石斛原球茎中加入液体培养基进行铁皮石斛原球茎快速增殖；所述液体培养基(1l)的配方如下：1896mgkno3、7.5mgmnso4·h2o、125mgcacl2·2h2o、28mgna2edta·2h2o、0.187mgcocl2·6h2o、0.18mgcuso4·5h2o、101mg(nh4)2so4、2mgznso4·7h2o、22.8mgfeso4·7h2o、14mgvb1、0.4mgnamoo4·2h2o、3.5mgh3bo3、1.0mg烟酸、120mgnah2po4·h2o、310mgvc、360mgmgso4·7h2o、1.85mgvb6、288.56mg肌醇、1.2mg6-ba、0.6mgnaa、35g蔗糖、1.2mg水解乳蛋白、30g香蕉泥、30g土豆泥、余量为水。

培养得到的铁皮石斛原球茎见附图1-3，可以看出：采用本发明使铁皮石斛原球茎的增殖率较高，增殖系数能达到20倍，且原球茎显淡黄色，颗粒饱满圆润，在表面长有茸毛状物表明了铁皮石斛原球茎快速增生长状态好，增殖速率快，为铁皮石斛原球茎可大规模工业化生产替代铁皮石斛药材提供了新的方法。