本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种用硫代硫酸钠防止烟草外植体褐化的方法。
背景技术：
烟草在植物学中属于双子叶植物纲(Dicotycoledoneac)，管花目(Tubiflorae)，茄科(Solanaceae)，烟草属，烟草属是茄科植物第五大家族。目前烟草属物种中除普通烟草(N. tabacum L.)和黄花烟草被广泛用于烟草工业外，其余都被划为烟属烟草野生种。有报道称烟草常用于基础生化代谢、基因组进化、转基因等领域研究，而普通烟草作为研究植物的模式生物之一，是植物分子研究领域常用的重要工具。
植物组织培养过程中外植体褐化是影响组织培养的重要因素，褐化是由于组织中多酚氧化酶被激活，酚类物质被氧化后产生醌类物质，这类棕褐色物质会扩散到培养中，抑制其他酶的活性，毒害整个外植体组织。通过在培养基中添加防褐剂可以缓解组织培养中外植体的褐化现象。尽管引起褐化现象的因素较多，但选择合适的外植体，筛选合适的培养基和培养条件能有效地防止褐化。
但是烟草在组织培养过程中的褐化问题是多发的常见的，几乎不可避免，褐化会导致植株的死亡，也就是培养基中的植物不能继续进行培养，所以防止褐化是在烟草组织培养中要极力解决的问题。
本发明利用在培养基中添加防褐剂硫代硫酸钠(Na2S2O3)缓解烟草外植体褐化，相关方法未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用硫代硫酸钠防止烟草外植体褐化的方法；该方法可以对植物组培过程中出现的褐化问题得到有效缓解，进而对植物组织培养具有重要作用。
本发明采用解决技术问题方案如下：
一种用硫代硫酸钠防止烟草外植体褐化的方法，包括如下步骤：
步骤（1），植物种子的消毒：取饱满的植物种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO3消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水；
步骤（2），植物种子培养：将步骤(1)得到的消毒后的植物种子接种到MS培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d，种子发芽长成为幼苗，所述的MS培养基为：MS基本培养基+30g/L蔗糖+4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7 ；
步骤（3），植物外植体培养：将步骤(2)中得到的种子幼苗，利用打孔器打孔获得烟草叶盘，将叶盘置于MS分化培养基中培养，在温度28℃时，光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养5天，得到烟草愈伤组织，所述MS分化培养基为：MS 基本培养基+0.5mg/L萘乙酸NAA+2mg/L6-苄基腺嘌呤6-BA+30g/L蔗糖+4g/L琼脂，培养基的pH 值为5.7 ；
步骤（4），植物外植体防褐化培养：将步骤(3) 中得到的烟草愈伤组织置于MS初步防褐化培养基中培养，在温度28℃时，光照培养16h/d，光照强度30-50 μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，此条件下培养20d，得到烟草愈伤组织，MS初步防褐化培养基为：MS基本培养基中加入防褐添加剂1.0-5.0g/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)、30g/L蔗糖、4g/L琼脂，培养基的pH 值为5.7；
步骤（5），植物外植体的继代防褐化培养：
1）洋甘菊提取液的制备：选取刚过观赏期的洋甘菊摘下花朵洗净，榨取汁液，将汁液过滤除去固体残渣，在超净工作台中使用0.22μm滤头过滤灭菌，制成无菌提取液；
2）金盏花提取液的制备：选取刚过观赏期的金盏花摘下花朵洗净，榨取汁液，将汁液过滤除去固体残渣，在超净工作台中使用0.22μm滤头过滤灭菌，制成无菌提取液；
3）西红柿提取液的制备：西红柿带皮榨取汁液，将汁液过滤除去残渣，在超净工作台中使用0.22μm滤头过滤灭菌，制成无菌提取液；
4）将步骤(4)中得到的初步防褐化植物外植体置于MS继代防褐化培养基中，在培养温度28℃时，光照培养16h/d，25℃黑暗培养8h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)的条件下培养20d，得到褐化率为18.7-23.3％的植物外植体；所述的MS继代防褐化培养基为：MS基本培养基中加入防褐添加剂100-200mg/L洋甘菊提取液、100-200mg/L金盏花提取液、100-200mg/L西红柿提取液、30g/L蔗糖、4g/L琼脂，培养基的pH 值为5.7。
1L的MS初代与继代防褐化培养基约可倒100mm培养皿30个，150mm培养皿10个，300mL培养瓶15个；
初步防褐化是利用硫代硫酸钠(Na2S2O3)作为抗氧化剂，它影响与褐化相关的过氧化物酶、多酚氧化酶活性，从而来缓解外植体褐化，继代防褐化是利用天然的抗氧化成分作为培养基添加剂，从而达到防褐化的效果，两种抗氧化剂的结合使用，缓解外植体褐化现象，并具有显著效果。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：烟草外植体经防褐化培养处理后，可以有效缓解外植体褐化现象，可以改善外植体整体的分化状态。添加硫代硫酸钠(Na2S2O3)在培养基中，以及添加天然的抗氧化成分，具有使用方便、成本低、效果好等优点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
步骤（1），烟草种子的消毒：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO3消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水；
步骤（2），烟草种子培养：将步骤(1)得到的消毒后的烟草种子接种到MS培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d，种子发芽长成为幼苗，所述的MS培养基为：MS基本培养基+30g/L蔗糖+4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；
步骤（3），烟草外植体培养：将步骤(2)中得到的种子幼苗，利用打孔器打孔获得烟草叶盘，将叶盘置于MS分化培养基中培养，叶盘置于MS分化培养基中，在培养温度28℃时，光照培养16h/d，25℃黑暗培养8h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，培养5天，得到烟草愈伤组织，所述MS分化培养基为：MS 基本培养基+0.5mg/L萘乙酸NAA+2mg/L6-苄基腺嘌呤6-BA+30g/L蔗糖+4g/L琼脂，培养基的pH 值为5.7；
步骤（4），烟草外植体防褐化培养：将步骤(3) 中得到的烟草外植体置于MS初步防褐化培养基中，在培养温度28℃时，光照培养16h/d，25℃黑暗培养8h/d，光照强度30-50 μmol/(m2·s)的条件下培养20d，得到烟草愈伤组织，MS初步防褐化培养基为：MS基本培养基中加入防褐添加剂2.0g/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)、30g/L蔗糖、4g/L琼脂，培养基的pH 值为5.7；
步骤（5），烟草外植体的继代防褐化培养：
1）洋甘菊提取液的制备：选取刚过观赏期的洋甘菊摘下花朵洗净，榨取汁液，将汁液过滤除去固体残渣，在超净工作台中使用0.22μm滤头过滤灭菌，制成无菌提取液；
2）金盏花提取液的制备：选取刚过观赏期的金盏花摘下花朵洗净，榨取汁液，将汁液过滤除去固体残渣，在超净工作台中使用0.22μm滤头过滤灭菌，制成无菌提取液；
3）西红柿提取液的制备：西红柿带皮榨取汁液，将汁液过滤除去残渣，在超净工作台中使用0.22μm滤头过滤灭菌，制成无菌提取液；
4）将步骤(4)中得到的初步防褐化烟草外植体置于MS继代防褐化培养基中，在培养温度28℃时，光照培养16h/d，25℃黑暗培养8h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)的条件下培养20d，得到褐化率为18.7％的烟草外植体；所述的MS继代防褐化培养基为：MS基本培养基中加入防褐添加剂100mg/L洋甘菊提取液、100mg/L金盏花提取液、100mg/L西红柿提取液、30g/L蔗糖、4g/L琼脂，培养基的pH 值为5.7。
实施例2
步骤（1）至步骤（3）与实施例1相同。
步骤（4），烟草外植体防褐化培养：将步骤(3)中得到的烟草外植体置于MS初步防褐化培养基中，在培养温度28/25℃，时间16/8h，光照强度30-50μmol/(m2·s)的条件下培养分别培养20d，MS初步防褐化培养基为MS基本培养基中加入防褐添加剂4.0g/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)，30g/L蔗糖，4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；
步骤（5），烟草外植体的继代防褐化培养：
1）至3）与实施例1相同；
4）将步骤(4)中得到的初步防褐化烟草外植体置于MS继代防褐化培养基中，在培养温度28℃时，光照培养16h/d，25℃黑暗培养8h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)的条件下培养20d，得到褐化率为20.5％的烟草外植体；所述的MS继代防褐化培养基为：MS基本培养基中加入防褐添加剂150mg/L洋甘菊提取液、金盏花提取液150mg/L、西红柿提取液150mg/L、30g/L蔗糖、4g/L的琼脂、培养基的pH 值为5.7。
实施例3
步骤（1）至步骤（3）与实施例1相同。
步骤（4），烟草外植体防褐化培养：将步骤(3)中得到的烟草外植体置于MS初步防褐化培养基中，在培养温度28/25℃，时间16/8h，光照强度30-50μmol/(m2·s)的条件下培养分别培养20d，MS初步防褐化培养基为MS基本培养基中加入防褐添加剂5.0g/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)，30g/L蔗糖，4g/L的琼脂，培养基的pH 值为5.7；
步骤（5），烟草外植体的继代防褐化培养：
1）至3）与实施例1相同；
4）将步骤(4)中得到的初步防褐化烟草外植体置于MS继代防褐化培养基中，在培养温度28℃时，光照培养16h/d，25℃黑暗培养8h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)的条件下培养20d，得到褐化率为23.3％的烟草外植体；所述的MS继代防褐化培养基为：MS基本培养基中加入防褐添加剂200mg/L洋甘菊提取液，金盏花提取液200mg/L，西红柿提取液200mg/L，30g/L蔗糖，4g/L的琼脂，培养基的pH 值为5.7。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。