本发明涉及白花蛇舌草组织培养育苗技术领域，尤其涉及一种白花蛇舌草继代培养基及其制备方法。
背景技术：
白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd)为茜草科一年生披散草本，高15-50cm，根细长，分枝，白花。茎略带方形或扁圆柱形，光滑无毛，从基部发出多分枝，花期春季，种子细小黄棕色；一年可收两季，春种8月收，秋种11月收。生长在海拔800米的地区，多生长在水田、田埂和湿润的旷地。主要分布在国内的福建、广东、香港、广西、海南、安徽、云南等地区；其味苦、淡，性寒，主要功效是清热解毒、消肿散结、利尿除湿，毒蛇咬伤等症，近年来发现白花蛇舌草对癌症和肝炎有较好的作用，临床用量较大。
但是，白花蛇舌草多为野生，家种很少，野生白花蛇舌草伪品较多，有水线草、纤花耳草、漆姑草、蚤缀、粟米草，伪品在新鲜时可通过细小的植株特征辨别，但干品和种子很难区分真伪。
而传统的白花蛇草育种方法是将白花蛇舌草种子直接播种到大田，这样的播种存在以下问题：
(1)种子质地较轻，播撒不均匀，较密的地方会影响长势；
(2)大田杂草多，混有伪品品种容易掺进白花蛇舌药材或种子；
(3)大田受温度，干湿度的影响，萌发率和成活率偏低；
(4)和组织培养相比，没有种苗增殖阶段。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种白花蛇舌草继代培养基，在温度为24-26℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为10-12小时/天的条件下，白花蛇舌草萌发的种苗能够大量增殖，且增殖苗数为原接种数的3-5倍，提高了种苗的增殖率，保证品种的纯正。
本发明的目的之二在于提供一种白花蛇舌草继代培养基的制备方法，流程简单，操作简便，制备成本低。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种白花蛇舌草继代培养基，所述培养基包括大量元素组分、微量元素组分、铁盐组分、有机物组分、植物激素组分、肌醇、蔗糖和琼脂粉；所述大量元素组分包括：硝酸钾、硝酸铵、二水氯化钙、七水硫酸镁和磷酸二氢钾；所述微量元素组分包括：碘化钾、硼酸、四水硫酸锰、七水硫酸锌、钼酸钠、五水硫酸铜和氯化钴；所述铁盐组分包括：硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠；所述有机物组分包括：烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素和甘氨酸；所述植物激素组分包括：吲哚乙酸和6苄基腺嘌呤。
进一步地，肌醇的浓度为96-100mg/L，蔗糖的质量百分浓度为2％，琼脂粉的浓度为4.8g/L。
进一步地，所述大量元素组分中各组分的浓度如下：硝酸钾1890-1900mg/L，硝酸铵1640-1650mg/L，二水氯化钙440-445mg/L，七水硫酸镁370-375mg/L，磷酸二氢钾160-170mg/L。
进一步地，所述微量元素组分中各组分的浓度如下：碘化钾0.8-0.83mg/L，硼酸6.0-6.2mg/L，四水硫酸锰22.3-23.0mg/L，七水硫酸锌8.6-9.0mg/L，钼酸钠0.2-0.25mg/L，五水硫酸铜0.025-0.028mg/L，氯化钴0.028-0.03mg/L。
进一步地，所述铁盐组分中各组分的浓度如下：硫酸亚铁27.5-29mg/L，乙二胺四乙酸二钠23-25mg/L。
进一步地，所述有机物组分中各组分的浓度如下：烟酸0.2-0.3mg/L，盐酸吡哆醇0.25-0.35mg/L，盐酸硫胺素0.2-0.3mg/L，甘氨酸0.8-0.9mg/L。
进一步地，所述植物激素组分中各组分的浓度如下：吲哚乙酸0.2mg/L、6苄基腺嘌呤1.5mg/L。
进一步地，所述培养基用酸碱指示剂将pH调至5.8-6.0。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种白花蛇舌草继代培养基的制备方法，包括：
大量元素母液制备步骤：分别取除二水氯化钙外的其余大量元素组分，配制成大量元素母液，所述大量元素母液中各组分的浓度均为各自配方浓度的10-20倍；二水氯化钙单独配制，二水氯化钙溶液的浓度为配方浓度的10-20倍；
微量元素母液制备步骤：分别取微量元素组分，配制成微量元素母液，所述微量元素母液中各组分的浓度均为各自配方浓度的10倍；
铁盐母液制备步骤：分别取铁盐组分，配制成铁盐母液，所述铁盐母液中各组分的浓度均为各自配方浓度的10-20倍；
有机物母液制备步骤：分别取有机物组分，配制成有机物母液，所述有机物母液中各组分的浓度均为各自配方浓度的10-20倍；
肌醇溶液制备步骤：取肌醇，用无菌水溶解，获取肌醇溶液；
植物激素母液制备步骤：分别取吲哚乙酸和6苄基腺嘌呤，用无菌水配制，获取浓度均为1mg/ml的吲哚乙酸母液和6苄基腺嘌呤母液；
混合定容加热步骤：分别取大量元素母液20-30ml、二水氯化钙溶液20-30ml、微量元素母液10-15ml、铁盐母液10-15ml、有机物母液10-15ml、肌醇溶液、吲哚乙酸母液0.2ml、6苄基腺嘌呤母液1.5ml、琼脂粉3.5-4.8g、蔗糖20-40g，混合，待蔗糖溶解后定溶到1L，然后加热直至琼脂粉融化，接着分装至培养瓶，冷却凝固后即得。
进一步地，还包括灭菌步骤：加热直至琼脂粉融化，分装到培养瓶中，每瓶30-40ml，盖紧瓶盖，将培养瓶放到温度为121-125℃、压力为0.15-0.3MPa的灭菌锅中，灭菌20-30min，灭菌完毕出锅，拧紧培养瓶盖并放到培养基储放室，冷却凝固后即得。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明所提供的白花蛇舌草继代培养基，组分易得，配方合理，在温度为24-26℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为10-12小时/天的条件下，白花蛇舌草萌发的种苗能够大量增殖，且增殖苗数为原接种数的3-5倍，种苗的增殖率高，得到纯净的白花蛇舌草种苗后，将其栽种在锯末中育种，即可得到正品白花蛇舌草及种子，保证品种的纯正。
(2)本发明所提供的白花蛇舌草继代培养基的制备方法，流程简单，操作简便，制备成本低。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
一种白花蛇舌草继代培养基，培养基包括大量元素组分(硝酸钾、硝酸铵、二水氯化钙、七水硫酸镁和磷酸二氢钾)、微量元素组分(碘化钾、硼酸、四水硫酸锰、七水硫酸锌、钼酸钠、五水硫酸铜和氯化钴)、铁盐组分(硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠)、有机物组分(烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素和甘氨酸)、植物激素组分(吲哚乙酸和6苄基腺嘌呤)、肌醇、蔗糖和琼脂粉。
作为优选的实施方式，大量元素组分中各组分的浓度如下：硝酸钾1890-1900mg/L，硝酸铵1640-1650mg/L，二水氯化钙440-445mg/L，七水硫酸镁370-375mg/L，磷酸二氢钾160-170mg/L；微量元素组分中各组分的浓度如下：碘化钾0.8-0.83mg/L，硼酸6.0-6.2mg/L，四水硫酸锰22.3-23.0mg/L，七水硫酸锌8.6-9.0mg/L，钼酸钠0.2-0.25mg/L，五水硫酸铜0.025-0.028mg/L，氯化钴0.028-0.03mg/L；铁盐组分中各组分的浓度如下：硫酸亚铁27.5-29mg/L，乙二胺四乙酸二钠23-25mg/L；有机物组分中各组分的浓度如下：烟酸0.2-0.3mg/L，盐酸吡哆醇0.25-0.35mg/L，盐酸硫胺素0.2-0.3mg/L，甘氨酸0.8-0.9mg/L；植物激素组分中各组分的浓度如下：吲哚乙酸0.2mg/L、6苄基腺嘌呤1.5mg/L；肌醇的浓度为96-100mg/L，蔗糖的质量百分浓度为2％，琼脂粉的浓度为4.8g/L。
作为优选的实施方式，培养基用酸碱指示剂将pH调至5.8-6.0。
本发明实施例所提供的白花蛇舌草继代培养基，组分易得，配方合理，在温度为24-26℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为10-12小时/天的条件下，白花蛇舌草萌发的种苗能够大量增殖，且增殖苗数为原接种数的3-5倍，种苗的增殖率高，得到纯净的白花蛇舌草种苗后，将其栽种在锯末中育种，即可得到正品白花蛇舌草及种子，保证品种的纯正。
一种白花蛇舌草继代培养基的制备方法，包括：
大量元素母液制备步骤：分别取除二水氯化钙外的其余大量元素组分，配制成大量元素母液，大量元素母液中各组分的浓度均为各自配方浓度的10-20倍；二水氯化钙单独配制，二水氯化钙溶液的浓度为配方浓度的10-20倍；
微量元素母液制备步骤：分别取微量元素组分，配制成微量元素母液，微量元素母液中各组分的浓度均为各自配方浓度的10倍；
铁盐母液制备步骤：分别取铁盐组分，配制成铁盐母液，铁盐母液中各组分的浓度均为各自配方浓度的10-20倍；
有机物母液制备步骤：分别取有机物组分，配制成有机物母液，有机物母液中各组分的浓度均为各自配方浓度的10-20倍；
肌醇溶液制备步骤：取肌醇，用无菌水溶解，获取肌醇溶液；
植物激素母液制备步骤：分别取吲哚乙酸和6苄基腺嘌呤，用无菌水配制，获取浓度均为1mg/ml的吲哚乙酸母液和6苄基腺嘌呤母液；
混合定容加热步骤：分别取大量元素母液20-30ml、二水氯化钙溶液20-30ml、微量元素母液10-15ml、铁盐母液10-15ml、有机物母液10-15ml、肌醇溶液、吲哚乙酸母液0.2ml、6苄基腺嘌呤母液1.5ml、琼脂粉3.5-4.8g、蔗糖20-40g，混合，待蔗糖溶解后定溶到1L，然后加热直至琼脂粉融化，接着分装至培养瓶，冷却凝固后即得。
作为优选的实施方式，还包括灭菌步骤：加热直至琼脂粉融化，分装到培养瓶中，每瓶30-40ml，盖紧瓶盖，将培养瓶放到温度为121-125℃、压力为0.15-0.3MPa的灭菌锅中，灭菌20-30min，灭菌完毕出锅，拧紧培养瓶盖并放到培养基储放室，冷却凝固后即得。
作为进一步的实施方式，在大量元素母液制备步骤中：除二水氯化钙单独进行配制存放外，大量元素组分中的其余组分混合配制。因为二水氯化钙与其他大量元素混合易沉淀，单独存放能够有效避免这个问题。
作为进一步的实施方式，在制备大量元素母液时，各组分的用量分别如下：硝酸钾370-390g、硝酸铵320-340g、二水氯化钙80-95g、七水硫酸镁70-75g、磷酸二氢钾30-35g。
作为进一步的实施方式，在制备微量元素母液时，各组分的用量分别如下：碘化钾1.0-1.66g，硼酸11.0-12.4g，四水硫酸锰40-46g，七水硫酸锌17.0-18.0g，钼酸钠0.2-0.5g，五水硫酸铜0.05-0.06g，氯化钴0.05-0.06g。
作为进一步的实施方式，在制备铁盐母液时，各组分的用量分别如下：硫酸亚铁20-25g，乙二胺四乙酸二钠21-26g。
作为进一步的实施方式，在制备有机物母液时，各组分的用量分别如下：烟酸1.0-1.5g，盐酸吡哆醇1.25-1.75g，盐酸硫胺素1.0-1.5g，甘氨酸4.0-4.5g。
作为进一步的实施方式，在肌醇溶液制备步骤中，取0.2-0.3g肌醇，用100ml无菌水溶解，获取肌醇溶液，肌醇溶液现配现用。
本发明实施例所提供的白花蛇舌草继代培养基的制备方法，流程简单，操作简便，制备成本低。
以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
实施例1-5
一种白花蛇舌草继代培养基，包括大量元素组分(硝酸钾、硝酸铵、二水氯化钙、七水硫酸镁和磷酸二氢钾)、微量元素组分(碘化钾、硼酸、四水硫酸锰、七水硫酸锌、钼酸钠、五水硫酸铜和氯化钴)、铁盐组分(硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠)、有机物组分(烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素和甘氨酸)、植物激素组分(吲哚乙酸和6苄基腺嘌呤)、肌醇、蔗糖和琼脂粉，培养基用酸碱指示剂将pH调至5.8-6.0。上述各组分在该继代培养基中的浓度如下表1所示。
表1实施例1-5的白花蛇舌草继代培养基的配方表
实施例1-5的白花蛇舌草继代培养基按照以下方法制备而成：
大量元素母液制备步骤：分别取大量元素组分，除二水氯化钙单独进行配制存放外，大量元素组分中的其余组分混合配制，获取大量元素母液，大量元素母液中各组分的浓度均为各自配方浓度的10倍；
微量元素母液制备步骤：分别取微量元素组分，配制成微量元素母液，微量元素母液中各组分的浓度均为各自配方浓度的10倍；
铁盐母液制备步骤：分别取铁盐组分，配制成铁盐母液，铁盐母液中各组分的浓度均为各自配方浓度的10倍；
有机物母液制备步骤：分别取有机物组分，配制成有机物母液，有机物母液中各组分的浓度均为各自配方浓度的10倍；
肌醇溶液制备步骤：取肌醇，用无菌水溶解，获取肌醇溶液；
植物激素母液制备步骤：分别取吲哚乙酸和6苄基腺嘌呤，用无菌水配制，获取浓度均为1mg/ml的吲哚乙酸母液和6苄基腺嘌呤母液；
混合定容加热步骤：分别取适量的大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物母液、肌醇溶液、吲哚乙酸母液、6苄基腺嘌呤母液、琼脂粉和蔗糖，混合，待蔗糖溶解后定溶到1L，然后加热直至琼脂粉融化，分装到培养瓶中，每瓶30-40ml，盖紧瓶盖，将培养瓶放到温度为123℃、压力为0.25MPa的灭菌锅中，灭菌25min，灭菌完毕出锅，拧紧培养瓶盖并放到培养基储放室，冷却凝固后即得。
效果评价及性能检测
取纯种的白花蛇舌草种苗，分别采取传统直播方式进行育苗，和采用实施例1-5的培养基进行育苗，两种培养方式的条件均为：温度为24-26℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为10-12h/天。对试验结果进行记录，结果如下表2所示。
表2白花蛇舌草种子进行传统直播和培养基组培育苗的试验结果记录表
从表2的记录可得，白花蛇舌草种苗采用实施例1-5的继代培养基进行组培育苗，生长到3-5cm需要的时间大大小于传统直播方式育苗方式，仅为传统直播育苗方式的一半；而增殖率和成活率均大大高于传统直播方式，且实施例1-5的伪品混淆率均为0％，实施例1-5的继代培养基能够有效保证白花蛇舌草品种的纯正。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。