本发明涉及菌丝体培养方法及其应用，特别涉及一种牛樟芝菌丝体的培养方法及其应用。
背景技术：
牛樟芝(Antrodia camphorata)又名樟芝、樟生薄孔菌、牛樟菇等，是一种担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌目、薄孔菌属的珍稀药用真菌。早前，它就被中国台湾原住居民用于治疗长期饮酒造成的肝病，被誉为“森林中的红宝石”和“药王之王”。
牛樟芝是台湾特有的药用真菌，异常珍贵，野生牛樟芝仅生于中国台湾地区海拔450-2000m之间的山地，牛樟树干腐朽心材的内壁中，或枯死倒伏之牛樟树木材潮湿表面，因此采集不易，被政府列为国宝级生物。牛樟芝主要的化学成分含有三萜、多糖、腺苷等，具有抗癌、免疫调节、抗炎等多种药理活性,近年来牛樟芝逐渐成为研究的热点。
牛樟芝具有广泛的生物活性，包括抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗疲劳、保护肝脏和免疫调节活性，其中尤其对肝病具有显著疗效。同时，牛樟芝还能减少运动后的乳酸产生，起到缓解体力疲劳的作用。其中的三萜成分是主要的抗肿瘤的活性成分，同时能够有效克制血液中的活性从而达到降压的作用和抗炎作用。
近年，牛樟芝产业得到快速发展，培育的地域不仅仅在我国台湾，大陆各地也开始迅速发展，但是牛樟芝在牛樟木屑上生长极为缓慢，无法满足市场需求，经过大量人力、物力和财力的投入，已经在牛樟芝的人工培养方面取得了很大的突破和发展，但是目前牛樟芝市场依然供不应求，故目前研究方向集中于寻找能使牛樟芝菌丝生长更好、周期更短的经济型培养基，使牛樟芝子实体的培养规模化，其中包括培养方式、培养基材种类、培养基配方组成、培养条件及培养周期与牛樟芝生物活性成分产出的种类和数量的关联性。此外，随着牛樟芝的培育技术的长足发展，其产品的开发还处于初中期，需在保健和医药方面努力做出进步，才能更好的造福人类，保护人类的健康。
技术实现要素：
发明目的：本发明通过对牛樟芝的培养方法进行摸索，通过摇床培养和液体深层发酵得到牛樟芝菌丝球，易于大量获得牛樟芝菌丝体。本发明的另一个目的是提供了一种牛樟芝饮品，使产品中的营养成分、活性物质、酶活性都较少丢失或受到破坏，保证产品的质量和提高人体免疫力增强体质的保健效果。
技术方案：本发明所述一种牛樟芝菌丝体的培养方法，包含以下步骤：(1)摇瓶扩大培养：将牛樟芝菌种接种到斜面培养基上，进行斜面培养；将经过斜面培养的牛樟芝菌种接种到摇瓶培养基中，进行一级摇瓶培养；将经过一级摇瓶培养牛樟芝菌种的接种到摇瓶培养基中进行二级摇瓶培养，所得牛樟芝菌种为生产摇瓶二级种；(2)种子罐扩大培养：步骤(1)中培养的生产摇瓶二级种接入发酵培养基中，进行扩大培养，得到一级牛樟芝菌种；(3)发酵罐扩大培养：将步骤(2)得到的一级牛樟芝菌种接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵罐培养，过滤，得牛樟芝菌丝体。
步骤(1)中，所述斜面培养为在将接种有牛樟芝菌种的斜面培养基在17-22℃条件下暗培养7-8d，待斜面长满菌丝体。所述斜面培养基由以下质量百分含量的组分组成：18-20％马铃薯；2-2.5％葡萄糖；1.5-2％蛋白胨；3-4％乳糖；3-4％酵母粉；0.6-0.8％维生素B1；5-7％琼脂；0.15-0.2％K2HPO4；0.1-0.2％MgSO4；余量为水。所述乳糖、酵母粉与维生素B1的质量比为1:1:0.2。
上述斜面培养基、摇瓶培养基和发酵培养基的pH值自然。
斜面培养基的配制方法为：将新鲜马铃薯去皮，切成若干小块(5mm*5mm)，放入水中煮沸，文火15-20min，用八层消毒纱布过滤，补足水分至1000mL，将蛋白胨、琼脂、K2HPO4、MgSO4等加入，后将制备好的培养基趁热分装。加富培养基中加入酵母粉、乳糖能比PDA培养基提供更丰富的碳源、氮源，牛樟芝菌更好地利用吸收，有利于菌种的生长。
步骤(1)中，所述一级摇瓶培养条件为接入经过斜面培养的牛樟芝菌种1.5-2cm2，以150-200rpm转速，在20-30℃条件下，振荡培养7-8d。待培养瓶种长出浓稠的菌液，作二级摇床培养的菌种。
步骤(1)中，所述二级摇瓶培养为将经过一级摇瓶培养的牛樟芝菌种与摇瓶培养基体积比为10-15％的接种量接种到摇瓶培养基中，以150-200rpm转速，在20-30℃条件下，培养5-8d。
步骤(2)中，所述扩大培养为生产摇瓶二级种与发酵培养基体积比为10-16％的接种量接种于发酵培养基中，控制罐温25-27℃，搅拌速度100-150rpm，通气量1:0.4-0.8v/v.min，发酵培养4-6d。
其中，上述一级摇瓶培养、二级摇瓶培养、发酵罐扩大培养所用的培养基组分与斜面培养的培养基组分大致相同，少了琼脂组分，即摇瓶培养基和发酵培养基的组分如下：18-20％马铃薯；2-2.5％葡萄糖；1.5-2％蛋白胨；3-4％乳糖；3-4％酵母粉；0.6-0.8％维生素B1；0.15-0.2％K2HPO4；0.1-0.2％MgSO4；余量为水，当乳糖、酵母粉与维生素B1的质量比为1:1:0.2，牛樟芝的菌丝体长势最好。
上述的培养方法培养的牛樟芝菌丝体。
上述牛樟芝菌丝体在饮料中的应用。
所述应用具体方法：(1)将所得的牛樟芝菌丝体过滤，酶解，得牛樟芝菌丝体酶解液；(2)将步骤(1)中得到的牛樟芝菌丝体酶解液制备成牛樟芝饮品；所述牛樟芝饮品由以下质量百分含量的组分组成：35-40％牛樟芝菌丝体酶解滤液、10-15％鲜橙浓缩汁、2-3％蜂蜜、4-6％蔗糖、0.01-0.015％山梨酸钾、柠檬酸0.3-0.4％、柠檬酸钠0.03-0.04％、果胶0.04-0.05％、0.09-0.1％黄原胶、食盐0.02-0.03％，余量为水。
进一步地，制备上述牛樟芝饮品的制备方法，包含以下步骤：(1)将发酵一天的发酵液，放罐，发酵醪料经过滤，得新鲜的牛樟芝菌丝球，清洗过滤后的牛樟芝菌丝体及发酵液；将牛樟芝菌丝体及发酵液进行均质研磨，均质为采用二级均质工艺，将料液预热至65-75℃，25-30MPa下均质处理10-15min，随后在15-20MPa均质压力下均质5-10min。采用二级均质工艺的主要目的在于进一步降低牛樟芝饮品中的粒径，使饮品体系更稳定，此外可以降低脂肪氧化的敏感性，且降低牛樟芝饮品的粒径可以有更强的风味和更好的口感，口感更佳细腻。(2)将牛樟芝菌丝球及发酵液在其中加入0.2％纤维素酶，混匀后于38℃条件下保温水解1.5h。(3)将步骤(2)中的混合料在100℃下杀菌10min，以破坏或杀灭致病及其他不良的微生物，精滤后得澄清透明的酶解滤液，以提高产品细腻度；(4)先将蔗糖用少量软水溶解过滤，然后分别加入牛樟芝菌丝球酶解滤液、溶化的果胶及黄原胶、柠檬酸、山梨酸钾搅拌均匀，最后补水至配方规定的量。(5)将定容后的料液加热至沸，趁热加灌入已灭菌的饮料瓶、压盖后105℃下杀菌10min、冷却后得牛樟芝菌丝发酵饮品。
除非另有说明，本发明所述“％”为质量百分浓度。
有益效果：本发明通过对牛樟芝培养基的改进和培养方法的改进，进行液体深层发酵及摇床培养得到牛樟芝菌丝体，此方法易于控制，易于大量获得牛樟芝菌丝体。清洗过滤后的菌丝体与发酵液后经混合胶磨，加入其它辅料，澄清灭菌后，得到菌丝发酵饮品。在处理过程中，营养成分和活性物质得到保留，可提高牛樟芝保健功能，增强功效。在牛樟芝菌丝发酵饮品，在保留牛樟芝菌丝原有的营养基础之上，，添加浓缩橙汁，使牛樟芝饮品的营养更加丰富，风味独特，口感更加细腻，减少了饮品在后期贮藏过程中的分层、褐变等现象。
具体实施方式
一、原料来源
1.1牛樟芝菌种Lactobacillus delbrueckiisubspbulgaricus江苏食用菌研究所所提供；
1.2黄原胶、果胶、纤维素酶等任丘市力辉化工有限公司；
1.3浓缩橙汁、蔗糖等为市售食品级；
1.4其余材料均市购所得。
二、检测方法
2.1感官评定
取试样置于烧杯中，在自然光下观察色泽和组织状态。闻其气味，用温开水漱口，品尝滋味。感官品质得分为3个指标总和。感官评价由20位具有品评经验的食品专业同学进行评价，取其平均值。
外观(10-30分)：细腻润滑，组织连贯均一，无结块和分层、无固体析出、色泽一致，无沉淀。
口感(10-40分)：口感爽滑，口味醇厚。
风味(10-30分)：饮品的酸甜度适中、饮品香气浓厚，独特饮品酵香。
表1牛樟芝菌丝发酵饮品L9(34)试验因素与水平
2.2牛樟芝菌丝发酵饮品稳定性测定
2.2.1观察一周，测定析出水层的高度Lw和样品总高度Ls，Lw/Ls以来表示自然分层比，值越小稳定性越好。
2.2.2离心沉淀率口将放置一段时间的饮料摇匀，加入样品于离心管的3/4处，然后在2500r/min下离心8min，再弃去上部溶液,准确称取沉淀物重，利用式一计算离心沉淀率。
W＝m2-m1/m0-m1*100％
W：离心沉淀率；
m1：一用于装离心液体的塑料壳重，g；
m2：离心后，除去上清液时的壳重与沉淀总重，g；
m0：离心前液体与壳体总重，g。
2.3牛樟芝菌丝体鲜重测定方法
牛樟芝菌丝体发酵液，采用100目筛网过滤，将菌丝体用蒸馏水冲洗数次，沥干，称重后，即得牛樟芝菌丝体鲜重。
2.4牛樟芝菌丝体干重的测定方法
新鲜的牛樟芝菌丝体经热风干燥，温度控制为70℃，干燥3-4h，烘干至恒重得到牛樟芝菌丝体干品。
三、牛樟芝菌丝体制备
3.1牛樟芝菌丝体的培养
实施例1：牛樟芝菌接种到斜面培养基上，斜面培养基组分为18％马铃薯，2％葡萄糖，1.5％蛋白胨，3％乳糖，3％酵母粉，0.6％维生素B1，5％琼脂，0.15％K2HPO4，0.1％MgSO4，余量为水。在黑暗中17℃条件下培养数7d，待斜面长满牛樟芝菌丝，将牛樟芝菌种接种到摇瓶培养基中，进行一级摇瓶培养，得到生产摇瓶一级种，培养条件为摇瓶培养基与摇瓶的体积比为200:1000mL/mL，摇瓶培养基的组分为18％马铃薯，2％葡萄糖，1.5％蛋白胨，3％乳糖，3％酵母粉，0.6％维生素B1，0.15％K2HPO4，0.1％MgSO4，余量为水，接入1.5cm2的经斜面培养的菌种，150rpm振荡培养7d，温度20℃；将经过一级摇瓶培养牛樟芝菌种与摇瓶培养基按体积比为0.15:1进行接种，进行二级摇瓶培养，按上述一级摇瓶培养基和培养条件，再次扩大培养5d，得到生产摇瓶二级种。生产摇瓶二级种转接入装有发酵培养基的种子罐进行扩大培养得到发酵一级种，发酵培养基组分为18％马铃薯，2％葡萄糖，1.5％蛋白胨，3％乳糖，3％酵母粉，0.6％维生素B1，0.15％K2HPO4，0.1％MgSO4，余量为水，培养条件为接种量与发酵培养基的体积比为0.1:1，控制罐温25℃，搅拌速度100rpm，通气量1:0.4v/v.min，发酵培养4d；按种子罐扩大培养所述的发酵培养基和培养条件，将发酵一级种转接入装有发酵培养基的发酵罐培养，发酵一天放罐，发酵醪料经过滤，得新鲜的牛樟芝菌丝体。
实施例2：牛樟芝菌接种到斜面培养基上，斜面培养基组分为20％马铃薯，2.5％葡萄糖，2％蛋白胨，4％乳糖，4％酵母粉，0.8％维生素B1，7％琼脂，0.2％K2HPO4，0.2％MgSO4，余量为水。在黑暗中22℃条件下培养数8d，待斜面长满牛樟芝菌丝，将牛樟芝菌种接种到液体培养基中，进行一级摇瓶培养，得到生产摇瓶一级种，培养条件为摇瓶培养基与摇瓶的体积比为200:1000mL/mL，接入1.5cm2的经斜面培养的菌种，摇瓶培养基组分为20％马铃薯，2.5％葡萄糖，2％蛋白胨，4％乳糖，4％酵母粉，0.8％维生素B1，0.2％K2HPO4，0.2％MgSO4，余量为水。150rpm振荡培养7d，温度30℃；将经过一级摇瓶培养牛樟芝菌种与摇瓶培养基按体积比为0.2:1进行接种，进行二级摇瓶培养，按上述一级摇瓶培养基和培养条件，再次扩大培养8d，得到生产摇瓶二级种。生产摇瓶二级种转接入装有发酵培养基的种子罐进行扩大培养得到发酵一级种，发酵培养基组分为20％马铃薯，2.5％葡萄糖，2％蛋白胨，4％乳糖，4％酵母粉，0.8％维生素B1，7％琼脂，0.2％K2HPO4，0.2％MgSO4，余量为水，培养条件为接种量与发酵培养基的体积比为0.16:1，控制罐温为27℃，搅拌速度150rpm，通气量1:0.8v/v.min，发酵培养6d；按种子罐培养所述的发酵培养基和培养条件，将发酵一级种转接入装有发酵培养基的发酵罐培养，发酵一天放罐，发酵醪料经过滤，得新鲜的牛樟芝菌丝体。
实施例3：牛樟芝菌接种到斜面培养基上，斜面培养基组分为19％马铃薯，2％葡萄糖，2％蛋白胨，2.5％乳糖，3.5％酵母粉，0.7％维生素B1，6％琼脂，0.15％K2HPO4，0.1％MgSO4，余量为水。在黑暗中17-22℃条件下培养数7d，待斜面长满牛樟芝菌丝，将牛樟芝菌种接种到摇瓶培养基中，进行一级摇瓶培养，得到生产摇瓶一级种，培养条件为摇瓶培养基与摇瓶的体积比为200:1000mL/mL，接入1.5cm2的经斜面培养的菌种，摇瓶培养基组分为19％马铃薯，2％葡萄糖，2％蛋白胨，3.5％乳糖，3.5％酵母粉，0.7％维生素B1，0.15％K2HPO4，0.1％MgSO4，余量为水，在150rpm振荡培养7d，温度30℃；将经过一级摇瓶培养牛樟芝菌种与摇瓶培养基按体积比为0.15:1进行接种，进行二级摇瓶培养，按上述一级摇瓶培养基和培养条件，再次扩大培养6d，得到生产摇瓶二级种。生产摇瓶二级种转接入装有发酵培养基的种子罐进行扩大培养得到发酵一级种，培养条件为接种量与发酵培养基的体积比为0.14:1，发酵培养基组分为19％马铃薯，2％葡萄糖，2％蛋白胨，2.5％乳糖，3.5％酵母粉，0.7％维生素B1，6％琼脂，0.15％K2HPO4，0.1％MgSO4，余量为水，控制罐温26℃，搅拌速度150rpm，通气量1:0.6v/v.min，发酵培养5d；按种子罐培养所述的发酵培养基和培养条件，将发酵一级种转接入装有发酵培养基的发酵罐培养，发酵一天放罐，发酵醪料经过滤，得新鲜的牛樟芝菌丝体。
对比例1：斜面培养基组分为18％马铃薯，2％葡萄糖，1.5％蛋白胨，3％乳糖，3％酵母粉，0.3％维生素B1，5％琼脂，0.15％K2HPO4，0.1％MgSO4，余量为水；摇瓶培养基和发酵培养基为18％马铃薯，2％葡萄糖，1.5％蛋白胨，3％乳糖，3％酵母粉，0.3％维生素B1，0.15％K2HPO4，0.1％MgSO4，余量为水，其余同实施例1。
对比例2：斜面培养基组分为18％马铃薯，2％葡萄糖，1.5％蛋白胨，3％乳糖，3％酵母粉，0.45％维生素B1，5％琼脂，0.15％K2HPO4，0.1％MgSO4，余量为水；摇瓶培养基和发酵培养基的组分为18％马铃薯，2％葡萄糖，1.5％蛋白胨，3％乳糖，3％酵母粉，0.45％维生素B1，0.15％K2HPO4，0.1％MgSO4，余量为水，其余同实施例1。
对比例3：斜面培养基组分为18％马铃薯，2％葡萄糖，1.5％蛋白胨，3％乳糖，3％酵母粉，0.75％维生素B1，5％琼脂，0.15％K2HPO4，0.1％MgSO4，余量为水；摇瓶培养基和发酵培养基组分为18％马铃薯，2％葡萄糖，1.5％蛋白胨，3％乳糖，3％酵母粉，0.75％维生素B1，5％琼脂，0.15％K2HPO4，0.1％MgSO4，余量为水，其余同实施例1。
对比例4：斜面培养基组分为18％马铃薯，2％葡萄糖，1.5％蛋白胨，3％乳糖，3％酵母粉，0.9％维生素B1，5％琼脂，0.15％K2HPO4，0.1％MgSO4，余量为水；摇瓶培养基和发酵培养基组分为18％马铃薯，2％葡萄糖，1.5％蛋白胨，3％乳糖，3％酵母粉，0.9％维生素B1，5％琼脂，0.15％K2HPO4，0.1％MgSO4，余量为水，其余同实施例1。
3.2牛樟芝菌丝体的理化性质测定
表2培养基组分对菌丝体生长的影响
由表2的结果可以看出，当乳糖:酵母粉:VB1三者质量比控制在1:1:0.2、1:1:0.25及1:1:0.3时，牛樟芝菌丝体的生长状况良好，生长快，鲜重和干重在与在同等培养条件下显著提高。随着VB1比例增加至0.25以上时，牛樟芝菌丝球鲜重及干重增加不显著，故选择乳糖:酵母粉:VB1比例为1:1:0.2为最佳添加比例。
四、牛樟芝饮品的制备
4.1牛樟芝酶解液的制备
将实施例1制备的牛樟芝菌丝体发酵液制备的新鲜牛樟芝菌丝体，经浸泡、清洗、与发酵液同时进行研磨，菌丝体鲜重与发酵液的质量比为14.3:100，得牛樟芝菌丝体发酵液胶磨液，将料液预热至70±5℃，25-30MPa下均质处理10-15min，随后在15-20MPa均质压力下均质5-10min。在混合液中加入纤维素酶，使得纤维素酶在溶液中的质量百分浓度为0.2％，混匀后于38℃条件下保温水解1.5h，100℃条件下灭菌10min，得牛樟芝菌丝体酶解滤液。
2、牛樟芝饮品的制备
样品1：将5％蔗糖用三倍软水溶解过滤，过滤后滤液加入35％牛樟芝菌丝球酶解滤液、3％蜂蜜、10％鲜橙浓缩汁，25MPa下均质处理13min，随后，在20MPa均质压力下均质10min，均质后补水至100％。再将溶化后的果胶及黄原胶(0.04％+0.09％)、柠檬酸及柠檬酸钠(0.3％+0.03％)、0.01％山梨酸钾、0.02％食盐等加入，搅拌均匀后，控制脱气真空度为0.06MPa，脱气25min，脱气完成后加热料液至沸，趁热加灌入已灭菌的饮料瓶、压盖后105℃下杀菌10min、冷却后得牛樟芝菌丝发酵饮品。
样品2：40％牛樟芝菌丝球酶解滤液、15％鲜橙浓缩汁、2％蜂蜜、4％蔗糖、0.01％山梨酸钾、柠檬酸0.3％、柠檬酸钠0.03％、0.04％果胶、0.09％黄原胶、食盐0.02％，制备方法同样品1。
样品3：35％牛樟芝菌丝球酶解滤液、13％鲜橙浓缩汁、3％蜂蜜、5％蔗糖、0.015％山梨酸钾、柠檬酸0.3％、柠檬酸钠0.03％、0.04％果胶、0.09％黄原胶、食盐0.03％，制备方法同样品1。
样品4：37％牛樟芝菌丝球酶解滤液、14％鲜橙浓缩汁、3％蜂蜜、5％蔗糖、0.015％山梨酸钾、柠檬酸0.3％、柠檬酸钠0.03％、0.04％果胶、0.09％黄原胶、食盐0.03％，制备方法同样品1。
五、样品理化性质测定
5.1牛樟芝菌丝发酵饮品调配正交试验结果分析
表3牛樟芝菌丝发酵饮品调配L9(34)试验因素与水平
从表3牛樟芝菌丝发酵饮品调配工艺的正交试验结果中的R值可知，影响其综合评分的因素主次顺序为A＞B＞C＞D，即蔗糖量＞食盐添加量＞柠檬酸+柠檬酸钠＞果胶+黄原胶。依据综合评分的结果分析可知，优化的工艺组合均为A2B2C1D2，即蔗糖的添加量为5％，食盐添加量控制在0.02％，柠檬酸0.4％+柠檬酸钠0.04％，果胶0.04％及黄原胶0.09％。外观、口感及风味的综合值均保持在最高。
六、结果测定
表4样品检测结果
对样品进行性能测定，结果见表4。由表4的结果可以看出，按照不同设定比例对牛樟芝进行离心沉淀的检验及感官评分，表明在适宜的添加比例当中，离心沉淀率及感官差异不显著，证明在实际操作中，此牛樟芝菌丝球发酵饮品的产品在保证口感的同时，稳定性较高。