本发明涉及抑菌剂技术领域，尤其涉及一种聚氨基酸抑菌剂及应用。
背景技术：
抗生素的发明拯救了数以亿计人的生命，使人类免遭细菌感染的痛苦，可以说是医学上的一次革命。但是随着小分子抗生素的滥用，再加上细菌的短生命周期及基因水平转移特性，各种抗药细菌随之出现。致病性细菌的传播更是严重危及到人们正常的生活。一份最新研究显示，如果得不到控制，超级细菌到2050年将导致每年约1000万人丧命。耐药细菌已成为世界各国普遍关注的热点问题，关系到全球人类的健康、经济的发展以及社会的稳定。
与小分子抗生素相比，聚合物抑菌剂可以与带负电的细菌膜进行非特异性结合，进而插入细菌膜内部，导致细菌膜破裂，进而杀死细菌，所以聚合物抑菌剂不易产生耐药性。因此，开发和使用安全性高、抑菌效果好、可持续使用且可生物降解的抑菌聚合物材料是一个具有深远意义的重大课题。
氨基酸是一种可再生资源，主要由生物质(淀粉、纤维素等)原料经水解后发酵来合成，全球年产量达到百万吨级。目前，氨基酸主要作为食品和饲料添加剂，附加值较低。如何开发新的高附加值产品是氨基酸行业迫切需要解决的问题。支化聚氨基酸在抑菌领域的应用至今尚无报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种聚氨基酸抑菌剂及应用，以氨基酸为原料，制备的支化聚氨基酸聚合物具有优良的抑菌性能。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种聚氨基酸抑菌剂，包括聚氨基酸；
所述聚氨基酸由一种氨基酸单元均聚得到，或者由两种或两种以上的氨基酸单元共聚得到；
所述氨基酸单元具有式Ⅰ所示结构通式或其盐：
其中，
a、b、c、d、e和f独立的为0～6的整数，且1≤a+b+c+d+e+f≤20；
T1、T2、T3、T4、T5和T6独立的选自氢，C1～C18的烷基及其衍生物，C6～C30芳基及其衍生物，C3～C8的环烷基及其衍生物，C2～C8的烯、炔及其衍生物，C1～C8的烷氧基及其衍生物，羧酸及其衍生物，胺及其衍生物，氮杂环及其衍生物，氧杂环及其衍生物或硫杂环及其衍生物；且T1、T2、T3、T4、T5、T6中的至少一个选自C2～C8的烯、炔及其衍生物，C1～C8的烷氧基及其衍生物，羧酸及其衍生物，胺及其衍生物，氮杂环及其衍生物，氧杂环及其衍生物或硫杂环及其衍生物。
上述式Ⅰ为氨基酸单元的结构通式，所述聚氨基酸可以由两种或两种以上的氨基酸单元共聚得到；或者由一种氨基酸单元均聚得到。
所述盐可以为本领域技术人员熟知的氨基酸盐，优选为盐酸盐，硫酸盐，磷酸盐，碳酸盐或硝酸盐。
式Ⅰ中，a、b、c、d、e和f独立的为0～6的整数，且1≤a+b+c+d+e+f≤20。
优选的，所述a+b+c+d+e+f≤10。
[]中的T1、T2、T3、T4、T5、T6代表官能团的无规组合。
T1、T2、T3、T4、T5和T6独立的选自氢，C1～C18的烷基及其衍生物，C6～C30芳基及其衍生物，C3～C8的环烷基及其衍生物，C2～C8的烯，C2～C8的炔及其衍生物，C1～C8的烷氧基及其衍生物，C1～C8的羧酸及其衍生物，C1～C8的胺及其衍生物，C2～C8的氮杂环及其衍生物，C2～C8的氧杂环及其衍生物或C2～C8的硫杂环及其衍生物；且T1、T2、T3、T4、T5、T6中的至少一个选自C2～C8的烯、C2～C8的炔及其衍生物，C1～C8的烷氧基及其衍生物，C1～C8的羧酸及其衍生物，C1～C8的胺及其衍生物，C2～C8的氮杂环及其衍生物，C2～C8的氧杂环及其衍生物或硫杂环及其衍生物。
上述衍生物优选为C1～C5的烷基取代基，C1～C5的烷氧基取代基，卤素，羟基，巯基，硝基，氰基，C5～C8芳基，C5～C8杂芳基，C3～C5环烷基，羧基，氨基，酰胺基取代基，或者任意一个或多个C原子被O或S取代。
优选的，所述T1、T2、T3、T4、T5和T6独立的选自H，C1～C5烷基，或C1～C5的取代烷基；所述取代烷基优选含羟基取代基、巯基取代基、芳基取代基、杂芳基取代基、羧基取代基、杂环基取代基、酰胺基取代基、氨基取代基、或C原子被O或S取代。
上述芳基取代基、杂芳基取代基、杂环基取代基的碳原子个数优选为5～12个，更优选为5～8个。
上述羧基取代基、酰胺基取代基、氨基取代基的碳原子个数优选为1～8个，更优选为1～5个。
本发明优选的，所述T1、T2、T3、T4、T5和T6的端基独立的选自羧基、羟基、氨基、酰胺基、巯基、胍基或含N、S或O的杂环基。所述含N杂环基优选为咪唑基或苯并吡咯。
更优选的，所述T1、T2、T3、T4、T5和T6独立的选自以下任一结构：
上述聚氨基酸中，当T1、T2、T3、T4、T5和T6同时为H时，得到的聚氨基酸为直链结构；当两种或两种以上的氨基酸单元共聚时，至少一种氨基酸单元中，T1、T2、T3、T4、T5和T6不同时为H，得到的聚氨基酸为支链结构。
所述氨基酸单元优选包括赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、谷氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、色氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和蛋氨酸中的任意一种或多种。
本发明优选的，所述氨基酸单元至少包括一种碱性氨基酸单元。
当所述聚氨基酸为支链结构时，可以为均聚物或共聚物。
当为共聚物时，优选由两种以上的支化点氨基酸单元共聚得到；或者由一种或多种支化点氨基酸单元和一种或多种共聚氨基酸单元共聚得到。
所述支化点氨基酸单元优选为赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、谷氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、色氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、酪氨酸或半胱氨酸。
所述共聚氨基酸单元优选为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或蛋氨酸。
在共聚过程中，所述支化点氨基酸单元为聚氨基酸提供支化结构。
本发明优选的，所述共聚得到支化聚氨基酸的两种或两种以上的氨基酸单元至少包括一种碱性氨基酸单元。
更优选的，所述两种以上的氨基酸单元至少包括赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或多种。
当为均聚物时，所述聚氨基酸优选具有以下结构：
其中，r、u和q为整数，1≤r≤9，1≤u≤6，1≤q≤6。G优选为C2～C8的烯、炔及其衍生物，羧酸及其衍生物，烷基醇及其衍生物，胺及其衍生物，氮杂环及其衍生物，氧杂环及其衍生物，硫杂环及其衍生物中的一种；T和L独立的优选为氢，C1～C18的烷基及其衍生物，C6～C30芳基及其衍生物，C3～C8的环烷基及其衍生物，C2～C8的烯、炔及其衍生物，C1～C8的烷氧基，羧酸及其衍生物，胺及其衍生物，氮杂环及其衍生物，氧杂环及其衍生物，硫杂环及其衍生物中的一种。
上述衍生物优选为C1～C6的烷基取代基，C1～C5的烷氧基取代基，卤素，羟基，巯基，硝基，氰基，C5～C8芳基，C5～C8杂芳基，C3～C5环烷基，羧基，氨基，酰胺基取代基，或者任意一个或多个C原子被O或S取代。
均聚的氨基酸单元优选为赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或苏氨酸。
更优选的，所述形成聚氨基酸的氨基酸单元为碱性氨基酸单元。
在本发明的某些具体实施例中，所述支链聚氨基酸为聚赖氨酸、聚精氨酸、组氨酸或聚鸟氨酸。优选为聚赖氨酸或聚鸟氨酸。
本发明对所述支化聚氨基酸的制备方法并无特殊限定，可以按照本领域技术人员熟知的方法制备，优选按照以下方法制备：
将氨基酸混合，在惰性气体氛围中，在25～250℃反应1min～96h，得到支化聚氨基酸。
所述惰性气体优选为氮气。
所述反应温度优选为150～200℃，反应时间优选为30min～24h，更优选为2h～12h。
聚氨基酸的支化结构，使得该物质具有许多活性官能团，分子内存在空隙，可以与多物质发生反应，具有良好的生物相容性，且该抑菌剂可撕裂细菌膜造成其损伤，长期使用不会产生耐药性。
本发明优选的，对所述聚氨基酸进行以下任意一种或多种改性：
Ⅰ、氨基或酰胺基中的氨基被改性为以下基团：
Ⅱ、羟基被改性为-OR1或-OC(＝O)R2；
Ⅲ、巯基被改性为-SR3；
Ⅳ、羧基被改性为-C(＝O)NHR4或-C(＝O)OR5；
Ⅴ、胍基被改性为式Ⅴ-1所示基团；
Ⅵ、含氮杂环基团中的NH被改性为NR6；
其中，X、Y、Z、Q独立的选自氢，C1～C18的烷基及其衍生物，C6～C30芳基及其衍生物，C3～C18的环烷基及其衍生物，C2～C18的烯、炔及其衍生物，C1～C18的烷氧基及其衍生物，羧酸及其衍生物，胺及其衍生物，氮杂环及其衍生物，氧杂环及其衍生物或硫杂环及其衍生物；
R1、R2、R3、R4、R5、R6独立的选自H、C1～C18的烷基及其衍生物，C6～C30芳基及其衍生物，C3～C18的环烷基及其衍生物，C2～C18的烯、炔及其衍生物，C1～C18的烷氧基及其衍生物，羧酸及其衍生物，胺及其衍生物，氮杂环及其衍生物，氧杂环及其衍生物或硫杂环及其衍生物；且R1、R3、R5、R6不为H。
上述衍生物优选为C1～C5的烷基取代基，C1～C5的烷氧基取代基，卤素，羟基，巯基，硝基，氰基，C5～C8芳基，C5～C8杂芳基，C3～C5环烷基，羧基，氨基，酰胺基取代基，或者任意一个或多个C原子被O或S取代。
更优选的，所述X、Y、Z、Q独立的选自氢、C1～C3烷基、C6～C8芳基、C3～C6环烷基、C1～C3烷氧基、C2～C5氮杂环、C2～C5氧杂环或C2～C5硫杂环；
R1、R2、R3、R4、R5、R6独立的选自C1～C3烷基、C6～C8芳基、C3～C6环烷基、C1～C3烷氧基、C2～C5氮杂环、C2～C5氧杂环或C2～C5硫杂环。
在本发明的某些具体实施例中，X、Y、Z、Q、R1、R2、R3、R4、R5、R6独立的选自氢、甲基、乙基、丁基、异丙基、乙酰基、甲酰基等。
本发明对上述含氮杂环基团中的N原子个数并无特殊限定，可以为本领域熟知的含氮杂环，N原子个数可以为但不限于1～3个。改性的N原子可以是全部N原子，也可以是1个或2个N原子的改性。
在本发明的某些具体实施例中，所述含氮杂环基团为咪唑基，被改性为式Ⅵ-1所示基团：
上述X、Y的范围同上，在此不再赘述。
上述改性可以提高聚氨基酸的抑菌性能，降低溶血比率及细胞毒性。
本发明对上述改性的方法并无特殊限定，采用本领域技术人员公知的方法即可。
本发明优选的，所述抑菌剂还可包括辅剂，所述辅剂的含量优选为0～99wt％。
本发明对所述辅剂的种类并无特殊限定，可以为本领域技术人员熟知的抑菌剂适用的辅剂。
所述的抑菌剂辅剂优选包括：[i]金属、金属离子、金属盐及其氧化物等无机抑菌剂；[ii]有机金属类、有机卤代物，胍类，有机硝基化合物类，有机磷及有机砷类，呋喃及其衍生物类，吡咯类，咪唑类，酰基苯胺类，噻唑及其衍生物类，季铵盐类等有机抑菌剂；[iii]天然抑菌肽类及高分子糖类等天然抑菌剂中的一种或几种；[iv]甘油、PEG、高分子糖类、多肽类、塑料、陶瓷、玻璃、磷灰石、树脂、纤维、橡胶等无毒添加剂或载体。
更优选的，所述抑菌剂辅剂为金属Ti，Ag+，Cu2+，Fe3+，Zn2+，季铵盐，卤胺，聚双胍类，卤代苯酚，壳聚糖，鱼精蛋白和天然抑菌肽等中的一种或多种。
在本发明的某些具体实施例中，所述辅剂为聚六亚甲基双胍。
本发明对所述抑菌剂的剂型并无特殊限定，可以为固体，溶液，悬浮液，乳浊液，水凝胶，油凝胶，气溶胶的一种或多种状态混合使用。
本发明对所述抑菌剂的制备方法并无特殊限定，将支化聚氨基酸和辅剂混合即可。
所述混合过程可以使用溶剂也可以不使用溶剂。所述溶剂可以为水或有机溶剂。
所述有机溶剂优选为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正庚烷、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、乙腈、石油醚、正己烷、环己烷、二氧六环、二甲基亚砜、二甲苯、甲苯、苯、氯苯、溴苯、丙酮和离子液体中的一种或多种。
本发明提供的上述抑菌剂制备工艺简单，设备要求不高，易于操作，而且材料易得，成本低廉，具有工业化应用前景，且具有广谱抑菌性。
本发明还提供了上述抑菌剂在抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌中的一种或多种中的应用。
上述抑菌剂可应用于食品、化妆品、医疗用品等领域。
比如食品防腐剂，食品保鲜剂，化妆品添加剂，漱口水，消毒液，多功能护理液，滴眼液中的防腐剂，游泳池消毒剂，还可用于牙膏、面部清洗剂、洗手液、消毒皂、果蔬储存的消毒防腐剂等。
与现有技术相比，本发明提供了一种聚氨基酸抑菌剂，包括聚氨基酸；所述聚氨基酸由一种氨基酸单元均聚得到，或者由两种以上的氨基酸单元共聚得到；所述氨基酸单元具有式Ⅰ所示结构通式。本发明所用的原料为氨基酸，为天然的生物材料，无毒性，无副作用，是一种绿色环保型的新型抑菌剂，使用者易于接受。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的聚氨基酸抑菌剂及应用进行详细描述。
实施例1
将100克鸟氨酸加入500mL的圆底烧瓶中，连接分水装置，抽换氮气三次，每次大于10分钟，最后保持氮气氛围，180℃下搅拌加热反应4h，停止加热，然后将反应体系冷却到室温，聚合物用甲醇溶解沉降到乙醚中，得到超支化聚鸟氨酸82.7克。
实施例2
将2g实施例1中所得的超支化聚鸟氨酸氨酸加热溶解在20mL的DMF中，加入5g碘甲烷，80℃搅拌反应24h，然后停止加热，冷却至室温，沉降到乙酸乙酯中，得到季铵盐改性的超支化聚鸟氨酸2.4g。
实施例3
将91.32克赖氨酸盐酸盐、20克NaOH加入500mL的圆底烧瓶中，连接分水装置，抽换氮气三次，每次大于10分钟，最后保持氮气氛围，180℃下搅拌加热反应6h，停止加热，聚合物用甲醇溶解沉降到乙醚中，得到超支化聚赖氨酸72.8克。
实施例4
将2g实施例3中所得的超支化聚赖氨酸溶解在5mL的甲醇中，0℃条件下缓慢滴加乙酰氯，升温至室温继续反应12h，然后沉降到乙酸乙酯中，得到乙酰基改性的超支化聚赖氨酸2.3g。
实施例5
将2g实施例1中所得的超支化聚鸟氨酸溶解在5mL的甲醇中，加入4.8g甲基异硫脲半硫酸盐及5mL三乙胺，60℃反应12h，然后停止加热，冷却至室温，沉降到乙酸乙酯中，得到胍基改性的超支化聚鸟氨酸2.1g。
实施例6
将2gε-聚赖氨酸溶解在5mL的水中，加入5.1g1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐及5mL三乙胺，60℃反应12h，然后停止加热，冷却至室温，沉降到乙酸乙酯中，得到胍基改性的ε-聚赖氨酸2.2g。
实施例7
称取5.6g N-苄氧羰基赖氨酸与250mL三口烧瓶中，加入100mL四氢呋喃，搅拌分散。小心称取2,5g三光气溶于30mL四氢呋喃中，在氮气的保护下缓慢滴入到反应体系中，搅拌下回流3h直至溶液完全澄清。反应结束后，加入大量的正己烷沉淀得到粗产品，用四氢呋喃-正己烷体系重结晶2次，真空干燥得到产物4,96g，产率88.6％。以DMF为溶剂，正丁胺为引发剂引发赖氨酸NCA开环，得到α-聚赖氨酸。
实施例8
将2gα-聚赖氨酸溶解在5mL的水中，加入5.1g1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐及5mL三乙胺，60℃反应12h，然后停止加热，冷却至室温，沉降到乙酸乙酯中，得到胍基改性的α-聚赖氨酸2.3g。
实施例9
将80克精氨酸和20克丝氨酸加入500mL的圆底烧瓶中，连接分水装置，抽换氮气三次，每次大于10分钟，最后保持氮气氛围，180℃下搅拌加热反应4h，停止加热，然后将反应体系冷却到室温，聚合物用甲醇溶解沉降到乙醚中，得到支化聚氨基酸81.2克。
实施例10
将2g实施例9中所得到的聚氨基酸溶解到20mL甲醇中，加入0.5g对甲苯磺酸，加热回流10h，将聚合物沉降到乙醚中，得到醚基改性的聚氨基酸2.2g
实施例11
将80克精氨酸和20克谷氨酸加入500mL的圆底烧瓶中，连接分水装置，抽换氮气三次，每次大于10分钟，最后保持氮气氛围，180℃下搅拌加热反应4h，停止加热，然后将反应体系冷却到室温，聚合物用甲醇溶解沉降到乙醚中，得到支化聚氨基酸80.2克。
实施例12
将2g实施例11中所得到的聚氨基酸溶解到20mL无水甲醇中，加入0.9g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和0.1g 4-二甲氨基吡啶
(DMAP)，室温搅拌10h，将聚合物沉降到乙醚中，得到甲酯改性的聚氨基酸2.1g
实施例13
将80克鸟氨酸和20半胱氨酸加入500mL的圆底烧瓶中，连接分水装置，抽换氮气三次，每次大于10分钟，最后保持氮气氛围，180℃下搅拌加热反应4h，停止加热，然后将反应体系冷却到室温，聚合物用甲醇溶解沉降到乙醚中，得到支化聚氨基酸80.2克。
实施例14
将2g实施例13中所得到的聚氨基酸溶解到20mL无水DMF中，通氩气除氧30min，加入0.9g丙炔醇和0.1g DMAP，室温搅拌10min。将反应混合物在紫外光(365nm)照射条件下室温反应120min，然后将聚合物沉降到乙醚中，得到羟基改性的聚氨基酸2.1g。
实施例15
将80克组氨酸和20g丝氨酸加入500mL的圆底烧瓶中，连接分水装置，抽换氮气三次，每次大于10分钟，最后保持氮气氛围，180℃下搅拌加热反应4h，停止加热，然后将反应体系冷却到室温，聚合物用甲醇溶解沉降到乙醚中，得到支化聚氨基酸80.2克。
实施例16
将2g实施例15中所得到的聚氨基酸溶解到20mL甲醇中，加入0.5g对甲苯磺酸，加热回流10h，将聚合物沉降到乙醚中，得到醚基改性的聚氨基酸2.2g。
实施例17
分别取实施例中制备的聚氨基酸36mg，用3mL无菌PBS溶解，得到12mg/mL的母液，按照以下方法测试聚氨基酸基抗菌剂的抗菌活力，实验结果参见表1-1和表1-2。
以下实施例中所用到的各种菌株均购自中国生物制品检定所。
采用96孔板法对聚氨基酸基抗菌剂进行抗菌活力检测，并用发酵法合成的ε-聚赖氨酸作为对照以评价所得的聚氨基酸基抗菌剂的抗菌能力，最小抑菌浓度(MIC)定义为与对照组相比，抑制90％的细菌增长的最低聚合物浓度。
用接种环从琼脂斜面培养基上挑取少量菌种于普通M-H培养基中，37℃培养过夜使菌种复苏并达到指数生长，稀释菌液使菌液浓度为106CFU/mL，每孔中加入175μL菌液及25μL不同浓度的聚合物溶液，将96孔板置于37℃培养20h，用酶标仪检测OD600值。
表1-1不同抗菌聚合物对不同细菌的MIC值的比较
表1-2不同抗菌聚合物对不同细菌的MIC值的比较
实施例18
分别取实施例中制备的聚氨基酸36mg，用3mL无菌PBS溶解，得到12mg/mL的母液，按照以下方法测试聚氨基酸基抗菌剂的抗体外溶血活性，实验结果参见表2-1和表2-2。
采用96孔板法对聚氨基酸基抗菌剂进行体外溶血活性检测，并用发酵法合成的ε-聚赖氨酸作为对照以评价所得的聚氨基酸基抗菌剂的体外溶血活性。
2％(v/v)红细胞悬液的制备，取新鲜健康人血2mL，用10mL无内毒素的PBS缓冲溶液稀释，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白质，使成脱纤血液，20℃条件下1000～1500r/min离心10～15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用PBS缓冲溶液按上述方法洗涤4次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用生理盐水配成2％的混悬液，供后续试验使用。
聚合物用PBS缓冲溶液稀释配成不同浓度的溶液，加入到96孔板中，单独的PBS缓冲溶液作为阴性对照，在水中溶解0.2％的Triton-X-100作为体外溶血活性检测的阳性对照，将清洗过的红细胞(2％v/v,50μL)加入到96孔板中，充分混合并培养。用酶标仪检测540nm下的吸收。
表2-1不同抗菌聚合物的体外溶血活性检测结果
表2-2不同抗菌聚合物的体外溶血活性检测结果
实施例19
本实施例用于检测聚氨基酸基抗菌剂的动物体内急性毒性，并用发酵法合成的ε-聚赖氨酸作为对照以评价所得的聚氨基酸基抗菌剂的动物体内急性毒性。
取小白鼠100只，雌雄各半，体重31±3g，分别取实施例3、4、5、6、8、10、12、14制备的聚氨基酸基抗菌剂按1mg/mL的剂量，每日一次连续15天给小鼠进行肌肉注射，观察小鼠的毒性反应。实验结果表明，连续15天肌肉注射后，除个别小鼠活力下降以外，其余均无明显的异常反应，且所有小鼠均存活，证明所得到的聚氨基酸基抗菌剂具有较小的体内毒性。
由上述实施例及比较例可知，本发明制备的改性聚氨基酸基抗菌剂具有优良的抑菌性能，且无毒性，无副作用。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。