本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及一种棉花外植体直接分化为胚性愈伤组织的方法及培养基。
背景技术：
棉花全基因组测序的完成使得确认和分离大量基因更加快捷简便，而基因功能的验证需要可靠及有效的遗传转化体系，将这些基因转化到棉花中验证候选基因的实用性。棉花的遗传转化过程主要包括植物表达载体上含有候选基因核酸序列的农杆菌侵染外植体、形成未分化的愈伤组织、诱导胚性愈伤组织发生、诱导胚、再生苗发生。其中由愈伤组织到胚性愈伤组织这一个过程在所有棉花品种的再生过程中属于一个瓶颈期，大部分不能再生的棉花都不能度过这一瓶颈期。
棉花转化和再生过程通常需要10-11个月左右，其中1/3(4-5个月)的时间用于胚性愈伤组织的获得。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种能够将胚性愈伤组织获得的时间缩短至2个月，而且胚性愈伤组织能够整块同步分化，组织的质地均一，生长状态均一，分化时间一致的棉花外植体直接分化为胚性愈伤组织的方法及培养基。
第一，本发明要求保护一种棉花外植体直接分化为胚性愈伤组织的方法。
本发明所提供的棉花外植体直接分化为胚性愈伤组织的方法，具体可包括如下步骤：将棉花外植体置于愈伤组织诱导培养基进行培养；所述愈伤组织诱导培养基中含有浓度为1.0-2.5mg/l(如2.0-2.5mg/l，更加具体的如2.5mg/l)的烯效唑。
第二，本发明要求保护一种提高棉花植株高效再生效率的方法。
本发明所提供的提高棉花植株高效再生效率的方法，具体可包括如下步骤：
(a1)在愈伤组织诱导培养基上培养棉花外植体以产生愈伤组织及胚性愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基中含有浓度为1.0-2.5mg/l(如2.0-2.5mg/l，更加具体的如2.5mg/l)的烯效唑；
(a2)在胚成熟培养基上培养所述胚性愈伤组织以产生成熟的胚；
(a3)在成苗培养基上培养所述成熟的胚以产生再生棉花幼苗。
在上述两种方法中，所述愈伤组织诱导培养基具体可为在msb基本培养基中加入烯效唑、kt、2,4-d、葡萄糖和gel(gelritegellangum)后得到的培养基；所述愈伤组织诱导培养基中烯效唑的终浓度为1.0-2.5mg/l(如2.0-2.5mg/l，更加具体的如2.5mg/l)、kt的终浓度为0.005-0.15mg/l(如0.1mg/l)、2,4-d的终浓度为0.001-0.15mg/l(如0.1mg/l)、葡萄糖的终浓度为20-35g/l(如30g/l)、gel(gelritegellangum)的终浓度为2.0-2.5g/l(如2.0g/l)；所述愈伤组织诱导培养基的ph为5.8-6.5(如5.8)。
在第二种方法中，所述胚成熟培养基具体可为在msb基本培养基中加入iaa、kt、葡萄糖和gel(gelritegellangum)后得到的培养基；所述胚成熟培养基中iaa的终浓度为0.001-0.01mg/l(如0.005mg/l)、kt的终浓度为0.005-0.15mg/l(如0.005mg/l)、葡萄糖的终浓度为20-35g/l(如30g/l)、gel的终浓度为2.0-2.5g/l(如2.0g/l)；所述胚成熟培养基的ph为6.0-6.8(如6.8)。
在第二种方法中，所述成苗培养基具体可为在msb基本培养基中加入kt、6-ba、蔗糖和gel(gelritegellangum)后得到的培养基；所述成苗培养基中kt的终浓度为0.001-0.01mg/l(如0.01mg/l)、6-ba的终浓度为0.005-0.2mg/l(如0.01mg/l)、蔗糖的终浓度为20-35g/l(如30g/l)、gel的终浓度为2.0-2.5g/l(如2.5g/l)；所述成苗培养基的ph为6.0-6.8(如6.8)。
在本发明中，所述msb基本培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：kno31.90g·l-1；nh4no31.65g·l-1；mgso4·7h2o0.37g·l-1；kh2po40.17g·l-1；cacl2·2h2o0.44g·l-1；mnso4·h2o16.900mg·l-1；znso4·7h2o8.600mg·l-1；h3bo36.200mg·l-1；ki0.830mg·l-1；namno4·2h2o0.250mg·l-1；cuso4·5h2o0.025mg·l-1；cocl·6h2o0.025mg·l-1；feso4·7h2o37.3mg·l-1；na2edta27.8mg·l-1；vb110.0mg·l-1；vb61.0mg·l-1；烟酸1.0mg·l-1；肌醇100.0mg·l-1。
在第一种方法中，将所述棉花外植体置于所述愈伤组织诱导培养基进行培养时的培养条件具体可为：28±2℃，光照强度1500～2000lx，每天光照培养14小时、暗培养10小时。
在第二种方法中，步骤(a1)中，在所述愈伤组织诱导培养基上培养所述棉花外植体时的培养条件具体可为：28±2℃，光照强度1500～2000lx，每天光照培养14小时、暗培养10小时。步骤(a2)中，在所述胚成熟培养基上培养所述胚性愈伤组织时的培养条件具体可为：28±2℃，光照强度1500～2000lx，每天光照培养14小时、暗培养10小时。步骤(a3)中，在所述成苗培养基上培养所述成熟的胚时的培养条件具体可为：28±2℃，光照强度1500～2000lx，每天光照培养14小时、暗培养10小时。
第三，本发明要求保护如下培养基和成套培养基。
所述培养基为前文任一所述的愈伤组织诱导培养基。
所述成套培养基由前文任一所述的愈伤组织诱导培养基、前文任一所述的胚成熟培养基和前文任一所述的成苗培养基组成。
第四，本发明要求保护所述培养基或所述成套培养基在如下任一中的应用：
(b1)棉花组织培养；
(b2)将棉花外植体直接分化为胚性愈伤组织；
(b3)提高棉花植株再生效率。
在本发明的一个实施例中，所述棉花外植体具体为棉花的下胚轴。更加具体的，所述棉花外植体为培养7天的棉花无菌苗的下胚轴；进一步地，所述下胚轴可切成2-3cm切段后使用。
以上本发明所提供的两种方法，以及本发明所提供的培养基和成套培养基，对所有棉花品种均适用，如中棉系列、珂字棉系列或鲁棉系列等，特别适用于中棉所24。
本发明通过在愈伤组织诱导培养基中添加一种烯效唑。能够使得外植体在45天左右即可分化为胚性愈伤组织，60天整块分化为胚性愈伤组织，从而跳过外植体到愈伤组织再到胚性愈伤组织这一漫长的过程，将愈伤组织诱导培养基和愈伤组织分化培养基合并，大大缩短了得到棉花胚胎干细胞的时间，提高了分化效率，实现了棉花组织的同步均一分化。可以大幅度提高农杆菌介导法的转化效率，缩短转化周期。本发明将在棉花的组织培养、基因功能验证及其品种改良中发挥重要作用。
附图说明
图1为在愈伤组织诱导培养基上培养棉花外植体以产生愈伤组织及胚性愈伤组织的结果。a为培养45天时的处理组和对照组；b为培养60天时的处理组和对照组。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用到的msb基本培养基由大量元素母液(msⅰ)、微量元素母液(msⅱ)、铁盐母液和b5维生素母液配制而成。具体如下：
(1)大量元素母液(msⅰ)的配制
如表1所示。称取下列药品，除cacl2·2h2o单独溶解后再混入母液中外，其余药品一起溶解，最终定容至1l，常温保存备用，如配制1lmsb基本培养基，需取50ml该母液。
表1大量元素母液msⅰ的成分
(2)微量元素母液(msⅱ)的配制
如表2所示。称取下列药品，一起溶解，若有少量沉淀，加少量1mol·l-1hcl溶解，定容至1l，4℃保存备用，如配制1lmsb基本培养基，需取5ml该母液。
表2微量元素母液msⅱ的成分
(3)铁盐母液的配制
如表3所示。称取下列药品，逐一溶解，混合后加热，避光放置冷却到室温，定容至0.5l，4℃保存备用，如配制1lmsb基本培养基，需吸取5ml该母液。
表3铁盐母液的成分
(4)b5维生素母液的配制：
如表4所示。称取下列药品，并逐一溶解，烟酸先用少量1mol·l-1hcl溶解，然后再与其他药品混合，定容至0.5l，冷藏保存备用，如配制1lmsb基本培养基，需取10ml该母液。
表4b5维生素母液的成分
实施例1、中棉所24的下胚轴组织培养
一、优选的培养基的配制方法：
愈伤组织诱导培养基：在msb基本培养基的基础上添加了烯效唑2.5mg/l，kt0.1mg/l，2,4-d0.1mg/l，葡萄糖30g/l，gel2g/l，ph5.8。各浓度均为相应物质在愈伤组织诱导培养基中的终浓度。
胚成熟培养基：在msb基本培养基的基础上添加了iaa0.005mg/l，kt0.005mg/l，葡萄糖30g/l，gel2g/l，ph6.8。各浓度均为相应物质在胚成熟培养基中的终浓度。
成苗培养基：在msb基本培养基的基础上添加了kt0.01mg/l，6-ba0.01mg/l，蔗糖30g/l，gel2.5g/l，ph6.8。各浓度均为相应物质在成苗培养基中的终浓度。
常规胚性愈伤组织诱导培养基：在msb基本培养基的基础上添加了iaa0.05mg/l，kt0.15mg/l，葡萄糖25g/l，gel2.5g/l，ph6.5。各浓度均为相应物质在成苗培养基中的终浓度。
上述培养基中的激素和其它组分均在灭菌前加入培养基中，培养基灭菌前，用1mkoh调ph值，然后在121℃、1.1kg/cm2的压力下高温高压灭菌14min。
二、中棉所24的下胚轴组织培养
1、在愈伤组织诱导培养基上培养棉花外植体以产生愈伤组织及胚性愈伤组织
处理组：以培养7天的棉花无菌苗的下胚轴为外植体，将其切成2-3cm切段，然后置于步骤一制备的愈伤组织诱导培养基上，于28±2℃，人工光照强度1500～2000lx，每天光照培养14小时、暗培养10小时的条件下进行培养。
对照组：将步骤一制备的愈伤组织诱导培养基中的烯效唑去除，其余操作同处理组。
结果显示：45天之后，处理组即可出现胚性愈伤组织，而对照组中没有出现分化的胚性愈伤组织(图1中a)；培养60天的处理组，全部整块分化为胚性愈伤组织，而对照组需要再次继代到常规胚性愈伤组织诱导培养基2个月之后才能分化(图1中b)。
2、在胚成熟培养基上培养所述胚性愈伤组织以产生成熟的胚
将步骤1处理组获得的胚性愈伤组织接种到步骤一制备的胚成熟培养基上，于28±2℃，人工光照强度1500～2000lx，每天光照培养14小时、暗培养10小时的条件下进行培养。60天后得到成熟的胚。
3、在成苗培养基上培养所述成熟的胚以产生再生棉花幼苗
将步骤2获得的成熟的胚接种到步骤一制备的成苗培养基上，于28±2℃，人工光照强度1500～2000lx，每天光照培养14小时、暗培养10小时的条件下进行培养。3-4个月后得到再生棉花幼苗。