本发明属于药用植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用间歇浸没生物反应器进行中药材地黄组织培养扩繁方法。
背景技术
地黄（rehmanniaglutinosalibosch.）是玄参科地黄属的多年生草本植物，植株株高10-40cm，在国内外均有分布。本发明所使用的材料为怀地黄，主产于河南省焦作市温县、武陟、沁阳、博爱、修武一带，是著名的四大怀药之一，有降血糖、抗氧化、治疗肝炎、促进胃液分泌、止血、抗炎免疫的功效。怀地黄具有极高的药用价值和营养价值，且应用广泛，广销于世界各地。由于人们对健康越来越关注，怀地黄的需求量也日益俱增。同时怀地黄的种植环境和农户种植量不断变化，目前已经造成了怀地黄种苗紧缺的现象。
应用植物组培快繁方法在一定程度上解决了怀地黄种苗短缺的现象，有关怀地黄的快速繁殖技术国内已有报道。但是，应用传统的植物组培的方法生产怀地黄种苗消耗大量的人力物力，生产成本居高不下，且培养周期长，种苗质量不高，仍不能满足市场需求。
利用间歇浸没培养生物反应器成功进行其它植物培养的研究已有相关报道。公开号为cn101720668a的专利公开了一种利用间歇浸没式间歇浸没培养系统进行甘蔗组织培养快繁的方法，其利用间歇浸没培养反应器对三个品种的甘蔗培养进行了介绍。公开号为cn103120126a的专利公开了一种利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养快繁方法。而怀地黄与这两种植物均相差较大，生理、生化方面也大不相同，相应的培养方法以及培养条件也均有较大差异，故以上文献专利中提及的步骤以及其中涉及到的具体的培养方式和培养条件并不能完全用于利用间歇浸没生物反应器培育怀地黄。且目前国内还没有关于利用间歇浸没生物反应器培养怀地黄的相关报道。
利用间歇浸没生物反应器进行怀地黄种苗的生产可以弥补传统方法生产的缺陷，为低成本的生产高质量的怀地黄种苗提供了有效的方法。鉴于利用间歇浸没式培养方法进行怀地黄种苗的生产未见报道和公开应用，因此，有必要研究出一种利用间歇浸没生物反应器进行怀地黄组织培养快速繁殖的方法。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题是提供了一种周期较短、成本低廉且操作简单的利用间歇浸没生物反应器进行中药材地黄组织培养扩繁方法。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，利用间歇浸没生物反应器进行中药材地黄组织培养扩繁方法，其特征在于具体过程为：
（1）按照配方基本培养液ms+激素naa0.01-0.05mg/l+激素6-ba0.1-0.5mg/l+蔗糖30g/l，调整ph值5.8-6.2配制培养液，将配制的培养液高温高压湿热灭菌后备用，再将间歇浸没生物反应器包扎，高温高压湿热灭菌后备用；
（2）在无菌环境中，将已灭菌的培养液倒入已灭菌的间歇浸没生物反应器中，再将怀地黄无菌组培苗除去叶面，取怀地黄带腋芽茎段直接接种于间歇浸没生物反应器中，其中怀地黄带腋芽茎段的接种密度为20-50个/l；
（3）设定间歇浸没生物反应器的参数为浸没频率3-15min/6-12h，培养时间为35-60d，设定培养环境条件为光照强度1500-1800lux，光照12h/d，温度25±1℃。
进一步优选，所述间歇浸没生物反应器中怀地黄带腋芽茎段的接种密度为40个/l。
进一步优选，所述间歇浸没生物反应器的设定参数为浸没频率5-10min/6-10h。
本发明所述的利用间歇浸没生物反应器进行中药材地黄组织培养扩繁方法，其特征在于具体步骤为：
（1）按照配方基本培养液ms+激素naa0.02mg/l+激素6-ba0.2mg/l+蔗糖30g/l，调整ph值5.8配制培养液，将配制的培养液高温高压湿热灭菌后备用，再将间歇浸没生物反应器包扎，高温高压湿热灭菌后备用；
（2）在无菌环境中，将已灭菌的培养液倒入已灭菌的间歇浸没生物反应器中，再将怀地黄无菌组培苗除去叶面，取怀地黄带腋芽茎段直接接种于间歇浸没生物反应器中，其中怀地黄带腋芽茎段的接种密度为40个/l；
（3）设定间歇浸没生物反应器的参数为浸没频率5min/6h，培养时间为60d，设定培养环境条件为光照强度1500-1800lux，光照12h/d，温度25±1℃，最终怀地黄培养增殖系数为7.75，将组培苗移栽后，植株的成活率达到90%以上且植株生长健康。
通过大量实验证实，间歇浸没生物反应器培养怀地黄适宜的怀地黄带腋芽茎段的接种密度20-50个/l，当接种量低于20个/l时，间歇浸没生物反应器中营养过剩，组培苗生长较快，茎较粗且叶片鲜艳肥大，但组培苗没有充满整个间歇浸没生物反应器，空间和营养利用率低；当怀地黄带腋芽茎段的接种密度高于50个/l时，间歇浸没生物反应器中组培苗拥挤，出现了畸形苗，有玻璃化现象，组培苗茎较细软，叶片小而暗淡，甚至会出现部分组培苗腐烂的现象。
采用本发明生产怀地黄种苗的技术方案，其产生的有益效果是：
1、增殖率高。间歇浸没液体培养系统是利用无菌空气产生的压力将液体培养基与植物组培苗间歇的接触，结合了固体培养最大化气体交换和液体培养营养充分利用的优点，怀地黄培养的增殖率可达7以上，是传统固体培养的2倍以上。
2、自动化程度高、劳动量小。由于间歇浸没液体培养系统是半自动化控制，整个培养过程只需要一次接种，省去了频繁转接和大批量组培瓶的灌装清洗等的操作，大大的减少了劳动量，降低了生产成本。
3、组培苗质量好，适应性强。同传统的固体培养相比减少了继代次数，降低了变异率，并且在培养过程中进行了充分的气体交换，减少甚至避免了组培苗玻璃化，环境适应能力强、生长健壮、移栽成活率高。
附图说明
图1是实施例3中怀地黄组培苗在间歇浸没生物反应器中的培养情况，其中①培养1周；②培养3周；③培养5周。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
（1）按照配方基本培养液ms+激素naa0.02mg/l+激素6-ba0.2mg/l+蔗糖30g/l，调整ph值5.8配制培养液，将配制的培养液高温高压湿热灭菌后备用，再将间歇浸没生物反应器包扎，高温高压湿热灭菌后备用；
（2）在无菌环境中，将已灭菌的培养液倒入已灭菌的间歇浸没生物反应器中，再将怀地黄无菌组培苗除去叶面，取怀地黄带腋芽茎段直接接种于间歇浸没生物反应器中，其中怀地黄带腋芽茎段的接种密度为20个/l；
（3）设定间歇浸没生物反应器的参数为浸没频率5min/6h，培养时间为60d，设定培养环境条件为光照强度1500-1800lux，光照12h/d，温度25±1℃。
怀地黄培养增殖系数为4，将组培苗移栽后，植株的成活率达到90%以上且植株生长健康。
实施例2
（1）按照配方基本培养液ms+激素naa0.02mg/l+激素6-ba0.2mg/l+蔗糖30g/l，调整ph值5.8配制培养液，将配制的培养液高温高压湿热灭菌后备用，再将间歇浸没生物反应器包扎，高温高压湿热灭菌后备用；
（2）在无菌环境中，将已灭菌的培养液倒入已灭菌的间歇浸没生物反应器中，再将怀地黄无菌组培苗除去叶面，取怀地黄带腋芽茎段直接接种于间歇浸没生物反应器中，其中怀地黄带腋芽茎段的接种密度为30个/l；
（3）设定间歇浸没生物反应器的参数为浸没频率5min/6h，培养时间为60d，设定培养环境条件为光照强度1500-1800lux，光照12h/d，温度25±1℃。
怀地黄培养增殖系数为4.6，将组培苗移栽后，植株的成活率达到90%以上且植株生长健康。
实施例3
（1）按照配方基本培养液ms+激素naa0.02mg/l+激素6-ba0.2mg/l+蔗糖30g/l，调整ph值5.8配制培养液，将配制的培养液高温高压湿热灭菌后备用，再将间歇浸没生物反应器包扎，高温高压湿热灭菌后备用；
（2）在无菌环境中，将已灭菌的培养液倒入已灭菌的间歇浸没生物反应器中，再将怀地黄无菌组培苗除去叶面，取怀地黄带腋芽茎段直接接种于间歇浸没生物反应器中，其中怀地黄带腋芽茎段的接种密度为40个/l；
（3）设定间歇浸没生物反应器的参数为浸没频率5min/6h，培养时间为60d，设定培养环境条件为光照强度1500-1800lux，光照12h/d，温度25±1℃。
怀地黄培养增殖系数为7.75，将组培苗移栽后，植株的成活率达到90%以上且植株生长健康。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。