本发明涉及食用菌固体菌种贮藏技术领域，尤其涉及一种可以延长食用菌固体菌种贮藏时间的方法。
背景技术
中国的食用菌养殖历史悠久，种类繁多，常见的有：香菇、草菇、蘑菇、木耳、银耳、猴头、红菇、牛肝菌等，食用菌味道鲜美、营养丰富，而且含有丰富的氨基酸，能够降低胆固醇及高血压症状，最新的医学研究显示，还具有抗癌的效果，因此发展食用菌养殖业是一项比较有市场前景产业。
目前的食用菌培育，在延长菌种贮藏时间上一般较为困难，适应性一般，例如：中国专利2010102918274公开了一种食用菌培养基制备方法，主要采用农作物秸秆和鲜马铃薯渣为原料调配，既解决了秸秆和鲜马铃薯渣的再利用问题，又提供了优质的食用菌培养基，但贮藏时间极短，需在特定环境下贮藏。
如上技术方案，目前食用菌固体菌种在贮藏时，其不足之处在于：需4-10℃低温冷藏，1-2个月内需续代一次，不易保存，贮藏时间短，容易发生变异。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种可以延长食用菌固体菌种贮藏时间的方法，用以克服现有技术的技术缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种可以延长食用菌固体菌种贮藏时间的方法，固体培养基由下列成分组成：海藻糖20-25g/l，酵母粉2-6g/l，蛋白胨1-2g/l，磷酸二氢钾1-2g/l，硫酸镁1.5-2g/l，琼脂15-20g/l，氧化石墨烯0.01-1.5g/l、n-丁基吡啶六氟磷酸盐0.1-0.85g/l，羧甲基纤维素钠0.1-0.5g/l、聚丙烯酰胺0.2-0.8g/l，纳米碳酸钙1.3-9.5g/l，月桂醇磺酸钠0.2-0.8g/l，余量为纯净水，培养基ph值调节至5-6；
制备过程包括：
步骤s1，氧化石墨烯水溶液制备：依据重量份数将氧化石墨烯、月桂醇磺酸钠、n-丁基吡啶六氟磷酸盐，超声分散5min；
步骤s2，活性组分的制备：在高速分散机分散作用下，将羧甲基纤维素钠、聚丙烯酰胺、纳米碳酸钙加入步骤s1的水溶液中，室温下继续搅拌10min；
步骤s3，培养基制作：将海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂加入上述步骤s2制得的活性组分中，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤得固体培养基，ph值调节至5-6；
步骤s4，接种过程：将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在22-25℃下黑暗条件下培养时间15-20天，在低于30℃的室温下贮藏待用。
进一步地，所述氧化石墨烯，其纯度≥99％，片层厚度0.5-2nm，片层长度为500-900nm。
进一步地，所述固体培养基由下列成分组成：海藻糖22g/l，酵母粉4g/l，蛋白胨1.5g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁1.8g/l，琼脂18g/l，氧化石墨烯1g/l、n-丁基吡啶六氟磷酸盐0.5g/l，羧甲基纤维素钠0.3g/l、聚丙烯酰胺0.5g/l，纳米碳酸钙5g/l，月桂醇磺酸钠0.5g/l，余量为纯净水，培养基ph值调节至5-6。
与现有技术相比本发明的有益效果在于，本发明提出了一种可以延长食用菌固体菌种贮藏时间的方法，氧化石墨烯独特的二维层状结构，在每一层的石墨烯单片上引入了许多氧基功能团，具有极强的吸附能力，相较于无定型的活性炭通过碳化、造孔通过物理反应吸附形成混合物，氧化石墨烯单片上随机分布着羟基和环氧基，在水性环境中部分通过化学反应与羟甲基纤维素、聚丙烯酰胺、纳米碳酸钙发生化学反应而形成化合物，甚至聚合物，以此来降低培养基的活性，使食用菌在较低的活性环境中存活，延长其贮藏时间；另一方面，氧化石墨烯氧化石墨烯可以破坏细菌的细胞膜，从而导致胞内物质外流并杀死细菌，是没有耐药性的物理“抗生素”，石墨烯不但可以通过对细菌细胞膜的插入进行切割，还可以通过对细胞膜上磷脂分子的大规模直接抽取，在食用菌繁殖迅猛时，氧化石墨烯还可以杀死部分食用菌，以进一步降低食用菌的繁殖速速；同时，通过月桂醇磺酸钠、n-丁基吡啶六氟磷酸盐相结合的离子水与粘结剂，将氧化石墨烯形成的聚合物均匀排列在培养基内。
进一步地，本发明采用海藻糖，利用其独特的功能特性使其除了可以作为天然食用甜味糖外，在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征，因此，海藻糖与氧化石墨烯的协同作用，大大延长了食用菌的贮藏时间。本实施例采用磷酸二氢钾、硫酸镁提供微量元素。
具体实施方式
以下，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
本发明实施例通过以石墨烯为载体，将石墨烯载体植入固体培养基中，延长食用菌种的贮藏时间。
本实施例的固体培养基由下列成分组成：海藻糖20-25g/l，酵母粉2-6g/l，蛋白胨1-2g/l，磷酸二氢钾1-2g/l，硫酸镁1.5-2g/l，琼脂15-20g/l，氧化石墨烯0.01-1.5g/l、n-丁基吡啶六氟磷酸盐0.1-0.85g/l，羧甲基纤维素钠0.1-0.5g/l、聚丙烯酰胺0.2-0.8g/l，纳米碳酸钙1.3-9.5g/l，月桂醇磺酸钠0.2-0.8g/l，余量为纯净水，培养基ph值调节至5-6。其中，纳米氧化石墨烯，其纯度≥99％，片层厚度0.5-2nm，片层长度为500-900nm。
培养基的制作过程包括：
步骤s1，氧化石墨烯水溶液制备：依据重量份数将氧化石墨烯、月桂醇磺酸钠、n-丁基吡啶六氟磷酸盐，超声分散5min；
步骤s2，活性组分的制备：在高速分散机分散作用下，将羧甲基纤维素钠、聚丙烯酰胺、纳米碳酸钙加入步骤s1的水溶液中，室温下继续搅拌10min；
步骤s3，培养基制作：将海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂加入上述步骤s2制得的活性组分中，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤得固体培养基，ph值调节至5-6；
步骤s4，接种过程：将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在22-25℃下黑暗条件下培养时间15-20天，在低于30℃的室温下贮藏待用。
在本实施例中，氧化石墨烯独特的二维层状结构，在每一层的石墨烯单片上引入了许多氧基功能团，具有极强的吸附能力，相较于无定型的活性炭通过碳化、造孔通过物理反应吸附形成混合物，氧化石墨烯单片上随机分布着羟基和环氧基，在水性环境中部分通过化学反应与羟甲基纤维素、聚丙烯酰胺、纳米碳酸钙发生化学反应而形成化合物，甚至聚合物，以此来降低培养基的活性，使食用菌在较低的活性环境中存活，延长其贮藏时间；另一方面，氧化石墨烯氧化石墨烯可以破坏细菌的细胞膜，从而导致胞内物质外流并杀死细菌，是没有耐药性的物理“抗生素”，石墨烯不但可以通过对细菌细胞膜的插入进行切割，还可以通过对细胞膜上磷脂分子的大规模直接抽取，在食用菌繁殖迅猛时，氧化石墨烯还可以杀死部分食用菌，以进一步降低食用菌的繁殖速速；同时，通过月桂醇磺酸钠、n-丁基吡啶六氟磷酸盐相结合的离子水与粘结剂，将氧化石墨烯形成的聚合物均匀排列在培养基内。
进一步地，本实施例采用海藻糖，利用其独特的功能特性使其除了可以作为天然食用甜味糖外，在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征，因此，海藻糖与氧化石墨烯的协同作用，大大延长了食用菌的贮藏时间。本实施例采用磷酸二氢钾、硫酸镁提供微量元素。
化工原料说明：含氧化石墨烯购自南京先丰纳米材料科技有限公司；离子液体购自上海默尼化工科技有限公司；其他化学试剂均购自国药集团，食品级，所有化工原料均为处理，直接使用。
仪器说明：超声波粉碎机jyd-250机购自宁波新芝生物科技股份有限公司；ikat18ultra-turrax高速分散机购自德国ika公司。
实施例1
本实施例采用平菇进行培育并设置对照组。
本实施例固体培养基由下列成分组成：海藻糖20g/l，酵母粉2g/l，蛋白胨1g/l，磷酸二氢钾2g/l，硫酸镁1.5g/l，琼脂15g/l，氧化石墨烯0.01g/l、n-丁基吡啶六氟磷酸盐0.1g/l，羧甲基纤维素钠0.1g/l、聚丙烯酰胺0.2g/l，纳米碳酸钙1.3g/l，月桂醇磺酸钠0.2g/l，余量为纯净水，培养基ph值调节至5-6。
其中，纳米氧化石墨烯，其纯度≥99％，片层厚度0.5-2nm，片层长度为500-900nm。
培养基的制作过程包括：
步骤s1，氧化石墨烯水溶液制备：依据重量份数将氧化石墨烯、月桂醇磺酸钠、n-丁基吡啶六氟磷酸盐，超声分散5min；
步骤s2，活性组分的制备：在高速分散机分散作用下，将羧甲基纤维素钠、聚丙烯酰胺、纳米碳酸钙加入步骤s1的水溶液中，室温下继续搅拌10min；
步骤s3，培养基制作：将海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂加入上述步骤s2制得的活性组分中，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤得固体培养基，ph值调节至5-6；
步骤s4，接种过程：将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在22-25℃下黑暗条件下培养时间15-20天，在低于30℃的室温下贮藏待用。
在本实施例1中，平均分成4份在低于30℃的室温下贮藏待用。
对照组不采用石墨烯及组分，对照组固体培养基由下列成分组成：海藻糖20g/l，酵母粉2g/l，蛋白胨1g/l，磷酸二氢钾2.0g/l，硫酸镁1.5g/l，琼脂15g/l，余量为纯净水，培养基ph值调节至5-6。
步骤s3，培养基制作：将海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂混合，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤得固体培养基，ph值调节至5-6；
步骤s4，接种过程：将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在22-25℃下黑暗条件下培养时间15-20天，在低于30℃的室温下贮藏待用。
在本实施例1中，平均分成4份在低于30℃的室温下贮藏待用。记录两种贮藏方式的菌种接入原种后对原种菌丝生长的影响，表中的防效(％)为各重复平均值。试验结果采用邓肯氏新复极差(dmrt)法进行分析，表中数据后相同大小写字母表示在1％和5％水平上差异不显著。
表1实施例1与对照组菌种贮藏时间与菌丝生长情况
从表1可以看出，对照组中的，传统固体种低温贮藏方式下，菌种能够在原种培养基上正常生长的最适贮藏时间为15-40天，并且，菌丝生长速度明显降低；而采用本发明实施例所制做的菌种接入原种培养基，在所试验的15-40天内，各处理菌丝生长速度分别为8.1、7.6、7.2、7.0mm/天，菌丝生长速度之间无显著差异。
实施例2
本实施例采用杏鲍菇进行培育并设置对照组。
本实施例固体培养基由下列成分组成：海藻糖25g/l，酵母粉6g/l，蛋白胨2g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁2g/l，琼脂20g/l，氧化石墨烯1.5g/l、n-丁基吡啶六氟磷酸盐0.85g/l，羧甲基纤维素钠0.5g/l、聚丙烯酰胺0.8g/l，纳米碳酸钙9.5g/l，月桂醇磺酸钠0.8g/l，余量为纯净水，培养基ph值调节至5-6。
其中，纳米氧化石墨烯，其纯度≥99％，片层厚度0.5-2nm，片层长度为500-900nm。
培养基的制作过程包括：
步骤s1，氧化石墨烯水溶液制备：依据重量份数将氧化石墨烯、月桂醇磺酸钠、n-丁基吡啶六氟磷酸盐，超声分散5min；
步骤s2，活性组分的制备：在高速分散机分散作用下，将羧甲基纤维素钠、聚丙烯酰胺、纳米碳酸钙加入步骤s1的水溶液中，室温下继续搅拌10min；
步骤s3，培养基制作：将海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂加入上述步骤s2制得的活性组分中，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤得固体培养基，ph值调节至5-6；
步骤s4，接种过程：将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在22-25℃下黑暗条件下培养时间15-20天，在低于30℃的室温下贮藏待用。
在本实施例2中，平均分成4份在低于30℃的室温下贮藏待用。
对照组不采用石墨烯及组分，对照组固体培养基由下列成分组成：海藻糖25g/l，酵母粉6g/l，蛋白胨2g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁2g/l，琼脂20g/l，余量为纯净水，培养基ph值调节至5-6。
步骤s3，培养基制作：将海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂混合，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤得固体培养基，ph值调节至5-6；
步骤s4，接种过程：将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在22-25℃下黑暗条件下培养时间15-20天，在低于30℃的室温下贮藏待用。
在本实施例1中，平均分成4份在低于30℃的室温下贮藏待用。记录两种贮藏方式的菌种接入原种后对原种菌丝生长的影响，表中的防效(％)为各重复平均值。试验结果采用邓肯氏新复极差(dmrt)法进行分析，表中数据后相同大小写字母表示在1％和5％水平上差异不显著。
表2实施例2与对照组菌种贮藏时间与菌丝生长情况
从表2可以看出，对照组中的，传统固体种低温贮藏方式下，菌种能够在原种培养基上正常生长的最适贮藏时间为15-40天，并且，菌丝生长速度明显降低；而采用本发明实施例所制做的菌种接入原种培养基，在所试验的15-40天内，各处理菌丝生长速度分别为8.2、7.7、7.5、7.3mm/天，菌丝生长速度之间无显著差异。
实施例3
本实施例采用金针菇进行培育并设置对照组。
本实施例固体培养基由下列成分组成：海藻糖22g/l，酵母粉4g/l，蛋白胨1.5g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁1.8g/l，琼脂18g/l，氧化石墨烯1g/l、n-丁基吡啶六氟磷酸盐0.5g/l，羧甲基纤维素钠0.3g/l、聚丙烯酰胺0.5g/l，纳米碳酸钙5g/l，月桂醇磺酸钠0.5g/l，余量为纯净水，培养基ph值调节至5-6。
其中，纳米氧化石墨烯，其纯度≥99％，片层厚度0.5-2nm，片层长度为500-900nm。
培养基的制作过程包括：
步骤s1，氧化石墨烯水溶液制备：依据重量份数将氧化石墨烯、月桂醇磺酸钠、n-丁基吡啶六氟磷酸盐，超声分散5min；
步骤s2，活性组分的制备：在高速分散机分散作用下，将羧甲基纤维素钠、聚丙烯酰胺、纳米碳酸钙加入步骤s1的水溶液中，室温下继续搅拌10min；
步骤s3，培养基制作：将海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂加入上述步骤s2制得的活性组分中，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤得固体培养基，ph值调节至5-6；
步骤s4，接种过程：将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在22-25℃下黑暗条件下培养时间15-20天，在低于30℃的室温下贮藏待用。
在本实施例3中，平均分成4份在低于30℃的室温下贮藏待用。
对照组不采用石墨烯及组分，对照组固体培养基由下列成分组成：海藻糖22g/l，酵母粉4g/l，蛋白胨1.5g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁1.8g/l，琼脂18g/l，余量为纯净水，培养基ph值调节至5-6。
步骤s3，培养基制作：将海藻糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂混合，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤得固体培养基，ph值调节至5-6；
步骤s4，接种过程：将上述制得的培养基在120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，在22-25℃下黑暗条件下培养时间15-20天，在低于30℃的室温下贮藏待用。
在本实施例1中，平均分成4份在低于30℃的室温下贮藏待用。记录两种贮藏方式的菌种接入原种后对原种菌丝生长的影响，表中的防效(％)为各重复平均值。试验结果采用邓肯氏新复极差(dmrt)法进行分析，表中数据后相同大小写字母表示在1％和5％水平上差异不显著。
表3实施例3与对照组菌种贮藏时间与菌丝生长情况
从表3可以看出，对照组中的，传统固体种低温贮藏方式下，菌种能够在原种培养基上正常生长的最适贮藏时间为15-40天，并且，菌丝生长速度明显降低；而采用本发明实施例所制做的菌种接入原种培养基，在所试验的15-40天内，各处理菌丝生长速度分别为8.3、7.8、7.6、7.4mm/天，菌丝生长速度之间无显著差异。
至此，已经结合所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征作出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。