本发明属于植物生物技术组织培养领域，具体涉及一种栝楼种苗快繁的方法。
背景技术
栝楼别名吊瓜、瓜蒌，其根、果、果皮、种子均可入药，其中，栝楼种子又名吊瓜子，为天然绿色休闲食品。栝楼为雌雄异株植物，雌性栝楼和雄性栝楼有不同的收获部位，具有不同的药用价值和经济价值，因此在人工栽培种控制栝楼雌雄植株的比例十分必要。以收获根为目的，可以种植100％的雄性栝楼，而以收获栝楼果、果皮、种子为目的则栽培的雌雄比例为10:1为宜，而自然分化的雌雄植株比例为3:7，这个比例对不同种植目的都不合适，而依据种子或幼苗对栝楼进行性别鉴定的技术暂未见报道。因而，通过种子播种繁殖，不仅需要大量的种子播种，栽培种植到开花结果才能够分辨雌雄株，浪费人力、物力、空间。因此，对栝楼进行雌雄定向繁殖则显得尤为重要。
发明专利cn104521756b公开了一种生产栝楼组培苗的方法，但是其中采用的培养材料未经脱毒处理，培养的组培苗易携带病毒影响种苗质量，从而影响栽培生产，另一方面，继代培养所选的材料为再生植株，即在增加再生植株数量的同时，需要消耗一批再生植株用来扩繁，间接减少了再生植株的数量，繁殖率降低，进一步，再生植株多次转接在新的同一种培养基中进行继代培养，容易产生激素积累，造成激素失调，影响种苗质量。且使用的ms培养基中部分元素的配比不适合栝楼的培养，组培苗容易黄化、叶片成勺状、叶缘焦枯。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种栝楼种苗快繁的方法。
本发明的技术方案为：
一种栝楼种苗快繁的方法，包括如下步骤：
(1)从栝楼种苗取材，得到组培苗，脱毒后，得到脱毒的组培苗；
(2)将所述脱毒的组培苗接种于培养基中进行培养，得到再生植株母株；
(3)剪取所述再生植株母株的部分枝条，将所述枝条剪成多节茎段，然后将所述多节茎段均接种于新的培养基中进行继代培养，得到多个继代再生植株；将剪枝后的再生植株于原培养基中继续培养；
(4)待步骤(3)所述剪枝后的再生植株长出新的枝条后，重复步骤(3)，得到新一批继代再生植株，重复进行多次继代培养，最后将全部继代再生植株和再生植株母株出瓶移栽，即得栝楼种苗。
步骤(1)中，所述组培苗为雌性带腋芽的茎段、雌性带根的完整植株、雌性芽丛、雄性带腋芽的茎段、雄性带根的完整植株、雄性芽丛中的任意一种。
步骤(1)中，进行所述脱毒的方法包括如下步骤：
将所述组培苗在温度为31℃-34℃、光照强度为2000-3000lux、光照时间为12小时/天的培养条件和温度为39℃-42℃、光照强度为2000-3000lux、光照时间为12小时/天的培养条件下交替培养，每种培养条件下培养1-2天，总共培养10-15天后，在解剖镜下剥取0.3±0.2mm的茎尖，接种于培养基中，先进行暗培养3-4天，然后以每2-3天增加500lux的速度将光照强度逐渐增加至2500lux，且每天光照12小时，在所述光照条件下培养25-35天后，即得脱毒的组培苗。
进行所述脱毒时的所述培养基与步骤(2)所述培养基、步骤(3)所述培养基均为同一种培养基。
所述培养基的原料组分包括：
硝酸钾3000-3200重量份、硝酸铵500-700重量份、磷酸二氢钾300-400重量份、乙二胺四乙酸钠60-80重量份、七水硫酸亚铁50-60重量份、白砂糖25000-35000重量份、琼脂4500-5500重量份、二水氯化钙410-500重量份、碘化钾0.5-1.5重量份、硼酸5.3-7.2重量份、四水硫酸锰18-26重量份、七水硫酸锌5-10重量份、七水硫酸镁300-400重量份、二水钼酸钠0.1-0.4重量份、五水硫酸铜0.01-0.05重量份、六水氯化钴0.01-0.05重量份、肌醇80-120重量份、烟酸0.2-0.8重量份、盐酸吡哆醇0.2-0.8重量份、盐酸硫胺素0.1-0.2重量份、甘氨酸1-3重量份、生长素0.02-0.2重量份。
所述生长素为吲哚乙酸或吲哚丁酸中的任意一种；
所述培养基的ph为5.6-6.0。
步骤(2)中，进行所述培养的温度为25-30℃，进行所述培养的光照强度为4000-6000lux，进行所述培养的时间为25-60天。
步骤(3)中，所述部分枝条为再生植株第3节以上枝条，将所述枝条剪成2-3节茎段，所述茎段靠近根部的叶子剪掉。
步骤(3)中，进行所述继代培养的培养温度为25-30℃，进行所述继代培养的光照强度为4000-6000lux，进行所述继代培养的时间为30-60天；进行所述继续培养的培养温度为25-30℃，进行所述继续培养的光照强度为4000-6000lux，进行所述继续培养的时间为25-60天。
所述步骤(1)-(3)均在无菌条件下进行。
本发明的有益效果为：
本发明所述的栝楼种苗快繁的方法，通过采用已经脱毒的已知雌雄的栝楼组培苗作为培养材料，能够定向生产大量脱毒栝楼雌株或雄株；本发明所述方法通过在再生植株母株上分批次剪取枝条来进行继代培养，实现了在同一再生植株母株上重复多次取材来进行培养，不仅减少再生植株的浪费，同时也避免现有技术中通过采用整个再生植株母株进行继代培养，在培养过程中，再生植株母株需多次重复接种于培养基中培养而造成激素积累；本发明采用的培养基，调整了ms培养基中硝态氮与氨态氮的比例，增加了磷酸二氢钾及铁盐的量，并加入了一定比例的生长素，能够使再生植株母株多次萌发新的枝条，作为继代培养以产生更多的继代再生植株，并且显著减少了植株黄化、叶片成勺状、叶缘焦枯的现象。本发明一次取材，多次扩繁，操作简单，效率高，可周年生产，实现栝楼种苗大规模生产，具有广阔的市场应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种栝楼种苗快繁的方法，包括如下步骤：
(1)从雌性栝楼种苗上取带腋芽的茎段，得到组培苗，在无菌条件下，将所述组培苗在温度为31℃、光照强度为2000lux、光照时间为12小时/天的培养条件和温度为39℃、光照强度为2000lux、光照时间为12小时/天的培养条件下交替培养，每种培养条件下培养1天，总共培养10后，在解剖镜下剥取0.3mm的茎尖，接种于培养基中，先进行暗培养3天，然后以每2天增加500lux的速度将光照强度逐渐增加至2500lux，且每天光照12小时，在所述光照条件下培养25天后，得到脱毒的组培苗；
(2)在无菌条件下，将脱毒的组培苗接种于培养基中，然后在温度为25℃，光照强度为4000lux的条件下培养60天，得到再生植株母株，所述培养基的原料组分为：
硝酸钾3000mg/l、硝酸铵500mg/l、磷酸二氢钾300mg/l、乙二胺四乙酸钠60mg/l、七水硫酸亚铁50mg/l、白砂糖25000mg/l、琼脂4500mg/l、二水氯化钙410mg/l、碘化钾0.5mg/l、硼酸5.3mg/l、四水硫酸锰18mg/l、七水硫酸锌5mg/l、七水硫酸镁300mg/l、二水钼酸钠0.1mg/l、五水硫酸铜0.01mg/l、六水氯化钴0.01mg/l、肌醇80mg/l、烟酸0.2mg/l、盐酸吡哆醇0.2mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、甘氨酸1mg/l、吲哚乙酸0.02mg/l；调节培养基的ph为5.6；
(3)在无菌条件下，剪取所述再生植株母株第3节以上枝条，将所述枝条剪成2节茎段后，将所述茎段靠近根部的一片叶子剪掉，将所述茎段均接种于新的培养基中，然后在温度为25℃，光照强度为4000lux的条件下进行继代培养30天，培养基组分与步骤(2)所述培养基相同，得到继代再生植株；将剪枝后的再生植株在温度为25℃，光照强度为4000lux的条件下，于原培养基中继续培养25天；
(4)待步骤(3)所述剪枝后的再生植株长出新的枝条后，重复步骤(3)1次，然后将全部继代再生植株和再生植株母株出瓶移栽，即得栝楼种苗。
实施例2
本实施例提供一种栝楼种苗快繁的方法，包括如下步骤：
(1)从雌性栝楼种苗上取带根的完整植株，得到组培苗，在无菌条件下，将所述组培苗在温度为34℃、光照强度为3000lux、光照时间为12小时/天的培养条件和温度为42℃、光照强度为3000lux、光照时间为12小时/天的培养条件下交替培养，每种培养条件下培养2天，总共培养15天后，在解剖镜下剥取0.4mm的茎尖，接种于培养基中，先进行暗培养4天，然后以每3天增加500lux的速度将光照强度逐渐增加至2500lux，且每天光照12小时，在所述光照条件下培养35天后，得到脱毒的组培苗；
(2)在无菌条件下，将脱毒的组培苗接种于培养基中，然后在温度为30℃，光照强度为6000lux的条件下培养25天，得到再生植株母株，所述培养基的原料组分为：
硝酸钾3200mg/l、硝酸铵700mg/l、磷酸二氢钾400mg/l、乙二胺四乙酸钠80mg/l、七水硫酸亚铁60mg/l、白砂糖35000mg/l、琼脂5500mg/l、二水氯化钙500mg/l、碘化钾1.5mg/l、硼酸7.2mg/l、四水硫酸锰26mg/l、七水硫酸锌10mg/l、七水硫酸镁400mg/l、二水钼酸钠0.4mg/l、五水硫酸铜0.05mg/l、六水氯化钴0.05mg/l、肌醇120mg/l、烟酸0.8mg/l、盐酸吡哆醇0.8mg/l、盐酸硫胺素0.2mg/l、甘氨酸3mg/l、吲哚丁酸0.02mg/l；调节培养基的ph为6.0；
(3)在无菌条件下，剪取所述再生植株母株第3节以上枝条，将所述枝条剪成3节茎段后，将所述茎段靠近根部的一片叶子剪掉，将所述茎段均接种于新的培养基中，然后在温度为30℃，光照强度为6000lux的条件下进行继代培养60天，培养基组分与步骤(2)所述培养基相同，得到继代再生植株；将剪枝后的再生植株在温度为30℃，光照强度为6000lux的条件下，于原培养基中继续培养60天；
(4)待步骤(3)所述剪枝后的再生植株长出新的枝条后，重复步骤(3)2次，然后将全部继代再生植株和再生植株母株出瓶移栽，即得栝楼种苗。
实施例3
本实施例提供一种栝楼种苗快繁的方法，包括如下步骤：
(1)从雌性栝楼种苗上取芽丛，得到组培苗，在无菌条件下，将所述组培苗在温度为32℃、光照强度为2200lux、光照时间为12小时/天的培养条件和温度为40℃、光照强度为2200lux、光照时间为12小时/天的培养条件下交替培养，每种培养条件下培养2天，总共培养15天后，在解剖镜下剥取0.2mm的茎尖，接种于培养基中，先进行暗培养3天，然后以每2天增加500lux的速度将光照强度逐渐增加至2500lux，且每天光照12小时，在所述光照条件下培养28天后，得到脱毒的组培苗；
(2)在无菌条件下，将脱毒的组培苗接种于培养基中，然后在温度为26℃，光照强度为4500lux的条件下培养40天，得到再生植株母株，所述培养基的原料组分为：
硝酸钾3200mg/l、硝酸铵700mg/l、磷酸二氢钾400mg/l、乙二胺四乙酸钠80mg/l、七水硫酸亚铁60mg/l、白砂糖35000mg/l、琼脂5500mg/l、二水氯化钙500mg/l、碘化钾1.5mg/l、硼酸7.2mg/l、四水硫酸锰26mg/l、七水硫酸锌10mg/l、七水硫酸镁400mg/l、二水钼酸钠0.4mg/l、五水硫酸铜0.05mg/l、六水氯化钴0.05mg/l、肌醇120mg/l、烟酸0.8mg/l、盐酸吡哆醇0.8mg/l、盐酸硫胺素0.2mg/l、甘氨酸3mg/l、吲哚丁酸0.02mg/l；调节培养基的ph为5.8；
(3)在无菌条件下，剪取所述再生植株母株第3节以上枝条，将所述枝条剪成2节茎段后，将所述茎段靠近根部的一片叶子剪掉，将所述茎段均接种于新的培养基中，然后在温度为26℃，光照强度为4500lux的条件下进行继代培养40天，培养基组分与步骤(2)所述培养基相同，得到继代再生植株；将剪枝后的再生植株在温度为26℃，光照强度为4500lux的条件下，于原培养基中继续培养30天；
(4)待步骤(3)所述剪枝后的再生植株长出新的枝条后，重复步骤(3)3次，然后将全部继代再生植株和再生植株母株出瓶移栽，即得栝楼种苗。
实施例4
本实施例提供一种栝楼种苗快繁的方法，包括如下步骤：
(1)从雄性栝楼种苗上取带腋芽的茎段，得到组培苗，在无菌条件下，将所述组培苗在温度为33℃、光照强度为2500lux、光照时间为12小时/天的培养条件和温度为40℃、光照强度为2500lux、光照时间为12小时/天的培养条件下交替培养，每种培养条件下培养2天，总共培养12天后，在解剖镜下剥取0.3mm的茎尖，接种于培养基中，先进行暗培养3天，然后以每2天增加500lux的速度将光照强度逐渐增加至2500lux，且每天光照12小时，在所述光照条件下培养26天后，得到脱毒的组培苗；
(2)在无菌条件下，将脱毒的组培苗接种于培养基中，然后在温度为28℃，光照强度为5000lux的条件下培养50天，得到再生植株母株，所述培养基的原料组分为：
硝酸钾3000mg/l、硝酸铵500mg/l、磷酸二氢钾300mg/l、乙二胺四乙酸钠60mg/l、七水硫酸亚铁50mg/l、白砂糖25000mg/l、琼脂4500mg/l、二水氯化钙410mg/l、碘化钾0.5mg/l、硼酸5.3mg/l、四水硫酸锰18mg/l、七水硫酸锌5mg/l、七水硫酸镁300mg/l、二水钼酸钠0.1mg/l、五水硫酸铜0.01mg/l、六水氯化钴0.01mg/l、肌醇80mg/l、烟酸0.2mg/l、盐酸吡哆醇0.2mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、甘氨酸1mg/l、吲哚乙酸0.02mg/l；调节培养基的ph为5.7；
(3)在无菌条件下，剪取所述再生植株母株第3节以上枝条，将所述枝条剪成3节茎段后，将所述茎段靠近根部的一片叶子剪掉，将所述茎段均接种于培养基中，然后在温度为28℃，光照强度为5000lux的条件下进行继代培养50天，培养基组分与步骤(2)所述培养基相同，得到继代再生植株；将剪枝后的再生植株在温度为28℃，光照强度为5000lux的条件下，于原培养基中继续培养40天；
(4)待步骤(3)所述剪枝后的再生植株长出新的枝条后，重复步骤(3)4次，然后将全部继代再生植株和再生植株母株出瓶移栽，即得栝楼种苗。
实施例5
本实施例提供一种栝楼种苗快繁的方法，包括如下步骤：
(1)从雄性栝楼种苗上取带根的完整植株，得到组培苗，在无菌条件下，将所述组培苗在温度为33℃、光照强度为2500lux、光照时间为12小时/天的培养条件和温度为40℃、光照强度为2500lux、光照时间为12小时/天的培养条件下交替培养，每种培养条件下培养2天，总共培养12天后，在解剖镜下剥取0.3mm的茎尖，接种于培养基中，先进行暗培养3天，然后以每3天增加500lux的速度将光照强度逐渐增加至2500lux，且每天光照12小时，在所述光照条件下培养30天后，得到脱毒的组培苗；
(2)在无菌条件下，将脱毒的组培苗接种于培养基中，然后在温度为28℃，光照强度为5000lux的条件下培养45天，得到再生植株母株，所述培养基的原料组分为：
硝酸钾3040重量份、硝酸铵600重量份、磷酸二氢钾340重量份、乙二胺四乙酸钠74.6重量份、七水硫酸亚铁55.6重量份、白砂糖30000重量份、琼脂5000重量份、二水氯化钙440重量份、碘化钾0.83重量份、硼酸6.2重量份、四水硫酸锰22.3重量份、七水硫酸锌8.6重量份、七水硫酸镁370重量份、二水钼酸钠0.25重量份、五水硫酸铜0.025重量份、六水氯化钴0.025重量份、肌醇100重量份、烟酸0.5重量份、盐酸吡哆醇0.5重量份、盐酸硫胺素0.1重量份、甘氨酸2重量份、吲哚丁酸0.2重量份；调节培养基的ph为5.8；
(3)在无菌条件下，剪取所述再生植株母株第3节以上枝条，将所述枝条剪成3节茎段后，将所述茎段靠近根部的一片叶子剪掉，将所述茎段均接种于培养基中，然后在温度为28℃，光照强度为5000lux的条件下进行继代培养45天，培养基组分与步骤(2)所述培养基相同，得到继代再生植株；将剩余的再生植株在温度为28℃，光照强度为5000lux的条件下，于原培养基中继续培养30天；
(4)待步骤(3)所述剪枝后的再生植株长出新的枝条后，重复步骤(3)5次，然后将全部继代再生植株和再生植株母株出瓶移栽，即得栝楼种苗。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。