本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种铁皮石斛的种子组培快速繁殖方法。
背景技术：
铁皮石斛是一种传统的珍稀名贵中药材，因具有抗肿瘤、抗衰老、抗声带疲劳、扩张血管和增强人体免疫力等作用，被称为“救命仙草”，名列“中华九大仙草”之首。随着铁皮石斛保健价值不断被开发，药材市场对铁皮石斛的需求量也逐渐上升，但由于长期过度采摘，中国的野生资源已经枯竭，而用传统的无性繁殖方式繁殖系数低，无法满足大面积栽培种苗需要，目前组培苗已经成为当前铁皮石斛种植的主要种苗来源。当前对铁皮石斛组培快繁技术研究较多，但大多数存在培养基成分复杂、育苗周期较长、耗费人工多、组培苗成本高等问题，严重制约了铁皮石斛的产业化发展。
综上，需要对现有技术进行改进。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种铁皮石斛的组培快速繁殖方法，采用本发明的方法可以快速简便地获得大量低成本的铁皮石斛组培种苗。
为解决上述技术问题，本发明提出一种铁皮石斛的种子组培快速繁殖方法，依次包括以下步骤：
1)、取材：
选用生长健壮的铁皮石斛上结的果龄150天以上未开裂的成熟蒴果，将其洗净、沥干后备用；
2)、种子的诱导萌发与分化：
将步骤1)所得的蒴果经消毒(常规消毒)后，切除其首尾两端各0.3～0.7cm后纵向剖开，取出种子，将种子均匀接种到种子萌发分化培养基上进行培养；
培养条件为：
首先进行暗培养10±1天，温度为25±1℃；
之后每天进行14小时光照，光照强度30～40μmolm-2·s-1，温度为25±1℃；10小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；
3)、幼苗的增殖：
待种子萌发并分化形成有两片小叶的幼苗(无根)时，将所得的幼苗转接于幼苗增殖培养基进行增殖培养，获得丛生苗；
培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmolm-2s-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；
4)、生根壮苗：
待增殖培养获得的丛生苗长至2-3cm高时，将丛生苗从基部进行分割形成单株小苗，转移到生根壮苗培养基上进行生根壮苗培养；
培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmolm-2s-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；
5)、移栽：
待生根壮苗培养获得的小苗长至4.0～5.0cm高、且长出长度大于等于2cm的根至少2条时，获得可出瓶种植种苗。
作为本发明铁皮石斛的组培快速繁殖方法的改进：
所述步骤2)中的种子萌发分化培养基为：ms+naa0.05～0.15mg/l+蔗糖25～35g/l+琼脂5～10g/l+0.3～0.7g/l活性炭，ph为5.5～6。
种子萌发分化培养基的具体制备方法如下：以ms基本培养基为基础，分别加入萘乙酸(naa)、蔗糖、琼脂和活性炭，均匀混合，利用1mol/l的koh或1mol/l的hcl调节ph为5.5～6.0；每1l的ms基本培养基中加0.05～0.15mgnaa、25～35g蔗糖、5～10g琼脂和0.3～0.7g活性炭。
作为本发明铁皮石斛的组培快速繁殖方法的进一步改进：
步骤3)中的幼苗增殖培养基为：ms+naa0.15～0.2mg/l+蔗糖25～35g/l+琼脂5～10g/l+活性炭0.3～0.7g/l，ph为5.5～6。
幼苗增殖培养基的具体制备方法如下：以ms基本培养基为基础，分别加入萘乙酸(naa)、蔗糖、琼脂和活性炭，均匀混合，利用1mol/l的koh或1mol/l的hcl调节ph为5.5～6.0；每1l的ms基本培养基中加0.15～0.2mgnaa、25～35g蔗糖、5～10g琼脂和0.3～0.7g活性炭。
作为本发明铁皮石斛的组培快速繁殖方法的进一步改进：
步骤4)中的生根壮苗培养基为ms+ba0.3～0.7mg/l+naa0.3～0.7mg/l+蔗糖25～35g/l+琼脂5～10g/l+活性炭0.3～0.7g/l，ph为5.5～6。
生根壮苗培养基的具体制备方法如下：以ms基本培养基为基础，分别加入苄氨基腺嘌呤(ba)、萘乙酸(naa)、蔗糖、琼脂和活性炭，均匀混合，利用1mol/l的koh或1mol/l的hcl调节ph为5.5～6.0；每1l的ms基本培养基中加0.3～0.7mgba、0.3～0.7mgnaa、25～35g蔗糖、5～10g琼脂和0.3～0.7g活性炭。
注：ba即为6-ba(6-苄氨基腺嘌呤)。
作为本发明铁皮石斛的组培快速繁殖方法的进一步改进：
首先将所得可出瓶种植的种苗同培养容器转移至拟驯化移栽的遮阴大棚中炼苗5～7天；
然后打开瓶盖，在生根壮苗培养基表面浇水，令生根壮苗培养基含水量为10±1％(体积比)，再于遮阴大棚中下放置2～3天后，将种苗基部的生根壮苗培养基(特指该生根壮苗培养基内的琼脂)洗净，晾干至根系发白；
最后将种苗以3～5棵为一丛移栽于的混合基质中，于遮阴大棚中进行培养；
所述遮阴大棚的透光率为60±5％，遮阴大棚内温度为20～28℃，相对湿度为80±5％；
所述混合基质为松树锯末和松树树皮按照1:1的体积比混合获得。
作为本发明铁皮石斛的组培快速繁殖方法的进一步改进：
所述步骤1)中洗净蒴果的方法为：将蒴果置于1％洗洁精溶液(体积比)中摇洗10min，再取出蒴果用自来水冲洗干净，沥干备用。
本发明与现有技术相比，具有如下技术优势：
1、本发明使用特定的种子萌发分化培养基，种子萌发形成原球茎与原球茎分化成苗在同一种培养基上进行，中间无须转接更换培养基。
而常规的铁皮石斛种子培养，原球茎诱导和分化分开进行，中间需要对原球茎进行一次转接更换培养基，人工耗费极大。
2、本发明组培过程中所采用的各培养基中所加激素种类少且浓度低，无须添加外源有机物，培养基制作简单方便，组培苗生产成本低。
3、本发明铁皮石斛从无菌播种到成苗可移栽约需要230-240天，生产周期相对现有技术(生产周期约为270-300天)较短。
4、本发明利用铁皮石斛种子进行种苗生产，繁殖系数高，繁殖速度快，操作简单简便，节省人力、物力，便于工厂化生产。
5、本发明的铁皮石斛种子组培快速繁殖法，铁皮石斛种子量大，培养基制作简便，组培苗生产成本低，可以在相对较短周期内生产大量遗传背景相同、长势一致的优质种苗(种子)，而且依靠实验室可以实现周年的长期提供优质种苗，尤其适用于铁皮石斛工厂化育苗。使用本发明同时可以有效地保护铁皮石斛这一珍稀野生植物资源、减少私挖滥采、形成可持续利用和合理开发相互协调的良性循环。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是人工授粉所结的铁皮石斛蒴果；
图2是实施例1中种子萌发分化形成的幼苗；
图3是实施例2中于幼苗增殖培养基中培养的幼苗(幼苗增殖培养基为ms+naa0.2mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7g/l+0.5g/l活性炭，ph为5.8)；
图4是实施例1中于壮苗生根培养基中培养的丛生苗。
图5是实施例1中拟移栽的种苗；
图6是实施例1中移栽后生长一个月的种苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、一种铁皮石斛的种子组培快速繁殖方法，依次进行以下步骤：
1)、取材：
如图1所示，取生长健壮的铁皮石斛植株上人工授粉所结的成熟蒴果(果龄150天以上且未开裂)，将其置于1％洗洁精溶液(体积比)中摇洗10min，再取出蒴果用自来水冲洗干净，沥干备用。
2)、种子的诱导萌发与分化：
将步骤1)洗净、沥干的蒴果经常规消毒后(即先用75％酒精浸泡处理2min，无菌水冲洗后，用0.1％升汞溶液灭菌10min，无菌水冲洗3～5次后用无菌滤纸吸干水分)，切除首尾两端各0.5cm后纵向剖开，取出种子，并将种子均匀接种到种子萌发分化培养基上培养。
培养条件为：首先黑布覆盖进行暗培养10天，培养温度为恒温25±1℃。
然后揭去黑布，每天14小时光照，光照强度30～40μmolm-2·s-1，温度为25±1℃；10小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行。
种子萌发分化培养基为：ms+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7g/l+活性炭0.5g/l，ph为5.8。
约30天左右，种子萌发变绿形成原球茎，该原球茎于同一种子萌发分化培养基中再分化形成幼苗。种子萌发分化率高达99％，分化速度快且幼苗整齐(如图2所示)。
3)、幼苗的增殖：
待种子萌发并分化形成具有两片小叶的无根幼苗时(种子萌发分化培养约75-80天)，将无根幼苗接种到幼苗增殖培养基上进行增殖培养，从而获得丛生苗。
培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmolm-2·s-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；
幼苗增殖培养基为：ms+naa0.15mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7g/l+0.5g/l活性炭，ph为5.8。
约15天后幼苗开始增殖，第90天统计幼苗平均增殖倍数为3.5，丛生苗细长，苗高2-3cm，有短根3-4条。
备注说明：为了获得更多的丛生苗，可将上述增殖所得丛生苗中较粗壮的小苗重复进行步骤3)的增殖过程。
4)、生根壮苗：
待增殖培养获得的丛生苗长至2-3cm左右高时(幼苗增殖培养约90-95天)，将上述丛生苗从基部进行分割形成单株小苗，接种到生根壮苗培养基上进行生根壮苗培养(如图4所示)；
培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmolm-2·s-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；
生根壮苗培养基为：ms+ba0.5mg/l+naa0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l+0.5g/l活性炭，ph为5.8。
约20天小苗开始生根，第60天统计生根率为100％。
5)、移栽：
待生根壮苗培养获得的小苗长至4.0～5.0cm高、且长出长度大于等于2cm的根至少2条时(生根壮苗培养约60天)，得可出瓶种植的种苗(如图5所示)；
该种苗出瓶种植的方法具体为：
首先将所得可出瓶种植的种苗同培养容器转移至拟驯化移栽的遮阴大棚(透光率为60％)中炼苗5～7天(温度为20～28℃)；
然后打开瓶盖，在生根壮苗培养基表面浇一层水(含水量为10％(体积比))，再于遮阴大棚中(温度为20～28℃)放置2-3天后，将种苗基部的生根壮苗培养基(特指该生根壮苗培养基内的琼脂)洗净，晾干至根系发白；
最后将种苗以3～5棵为一丛移栽于松树锯末：松树树皮(体积比)为1:1的混合基质中，于遮阴大棚(透光率为60％)中进行培养，培养温度为20～28℃。
本发明铁皮石斛从无菌播种到成苗可移栽约需要230-240天，在整个移栽过程中，控制遮阴大棚内相对湿度保持80％左右。
本实施例移栽后生长一个月的种苗如图6所示，其移栽成活率可达95％以上。
实施例2、将实施例1步骤3)幼苗增殖培养基中的naa浓度由“0.15mg/l”改为“0.2mg/l”，其余等同于实施例1。
如图3所示，无根幼苗于naa浓度为0.2mg/l的幼苗增殖培养基增殖。
幼苗的增殖结果为：90-95天后获得可进一步转接的丛生苗，第90天统计幼苗平均增殖倍数为3.8，丛生苗粗壮，苗高2-3cm，有短根2-3条。
待上述所得丛生苗长至2-3cm左右高时，将其按照实施例1步骤4)进行生根壮苗培养，约22天小苗开始生根，第60天统计生根率为100％。
对比例1、将实施例1步骤2)中的种子萌发分化培养基的基本培养基由“ms”更改为“1/2ms”，即，种子萌发分化培养基为：1/2ms基本培养基+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7g/l+0.5g/l活性炭，ph为5.8，其余等同于实施例1。
种子萌发分化结果为：种子萌发分化率只有72％，分化形成具有两片小叶的无根幼苗后生长缓慢(从无菌播种到成苗可移栽约需要260～270天)。
对比例2、将实施例1步骤2)中的种子萌发分化培养基中naa浓度由0.1mg/l改为0.2mg/l，ph为5.8，其余等同于实施例1。
种子萌发分化结果为：种子萌发分化率只有48％，部分种子萌发形成原球茎后变白，停止分化。分化形成的幼苗生长较快。
对比例3、将实施例1步骤2)中的种子萌发分化培养基中naa浓度改为由0.1mg/l改为0.5mg/l，ph为5.8，其余等同于实施例1。
种子萌发分化结果为：只有60％的种子能诱导萌发形成原球茎，而95％的原球茎后期变白，停止分化，种子萌发分化率只有3％。
对比例4、于实施例1步骤2)种子萌发分化培养基中添加ba1.0mg/l、马铃薯泥20g/l，即，种子萌发分化培养基为：ms+naa0.1mg/l+ba1.0mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7g/l+活性炭0.5g/l+马铃薯泥20g/l，其余等同于实施例1。
种子萌发分化结果为：种子萌发分化率只有20％，大部分种子萌发形成原球茎后变白，停止分化。
对比例5、将实施例1步骤3)幼苗增殖培养基中的naa浓度由0.15mg/l改为0.5mg/l，其余等同于实施例1。
幼苗的增殖结果为：90-95天后获得可进一步转接的丛生苗，第90天统计幼苗平均增殖倍数为2.5，丛生苗粗壮，苗高1-2cm，无根。
对比例6、于实施例1步骤3)幼苗增殖培养基添加马铃薯泥20g/l，即，幼苗增殖培养基为：ms+naa0.15mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7g/l+0.5g/l活性炭+马铃薯泥20g/l，其余等同于实施例1。
幼苗的增殖结果为：90-95天后获得可进一步转接的丛生苗，第90天统计幼苗平均增殖倍数为2.8，丛生苗生长势弱，苗高1-2cm，无根。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。