一种脐带间充质干细胞运输保护液及其保护方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种脐带间充质干细胞运输保护液及其保护方法，尤其涉及一种适用于远距离运输的脐带间充质干细胞运输保护液及其保护方法。

背景技术

脐带间充质干细胞来源于新生儿，相对于成人的间充质干细胞更加纯净、更加原始，细胞的增殖、分化及免疫调节能力更强；另外，相对于其它来源的间充质干细胞，脐带间充质干细胞从离断后的脐带组织中获得，对人体没有任何伤害，是间充质干细胞的理想来源。

在细胞治疗的新时代，脐带间充质干细胞被医学界称为万能细胞。脐带间充质干细胞体外显示有很高的分化能力，可分化成软骨细胞、脐带细胞、成骨细胞、成牙本质样细胞、真皮成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼细胞、心肌细胞、肝细胞，产生胰高血糖素细胞、生长抑素分泌细胞、神经胶质细胞(少突胶质细胞)和多巴胺能神经元等。在特定条件下，脐带间充质干细胞还能表示出标记的原始生殖样细胞。脐带间充质干细胞不仅在神经系统疾病的治疗中发挥疗效，同时也在心脏衰竭、肝硬化、肺纤维化、关节炎、糖尿病、克罗恩氏病、系统性红斑狼疮及硬皮病与不孕不育等疑难杂症的治疗中发挥作用。

但是在接受细胞治疗的病患的实际需求中，很多重症患者无法转移，只能接受外地生产的细胞制剂，细胞制剂在输注前处理过程比较简单，通常运输过程中用生理盐水来储存细胞，不能保证运输过程中细胞的稳定性，不能较长时间保持细胞活性，因此不适于远距离运输，间充质干细胞在输注过程中容易成团，全身注射脐带间充质干细胞后，大部分干细胞不能到达病灶部位，使得治疗效果不明显。而采用局部注射，不能有效改善患者免疫系统状况，从根本上面缓解病程。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种适合远距离运输的脐带间充质干细胞运输保护液，能保证细胞的活力和稳定性，且便于保存和运输。

具体地，本发明提供了一种脐带间充质干细胞运输保护液，该保护液含有以体积百分比计的以下组分：

其中，所述复方氨基酸原液的组分为每升原液含：精氨酸盐酸盐2.89g、组氨酸盐酸盐2.46g、亮氨酸3.795g、异亮氨酸1.70g、赖氨酸盐酸盐3.33g、苯丙氨酸2.83g、苏氨酸1.97g、缬氨酸1.36g、蛋氨酸1.06g、色氨酸0.39g、甘氨酸3.24g、丙氨酸1.88g、脯氨酸1.00g、酪氨酸0.11g、丝氨酸0.67g、盐酸半胱氨酸0.44g、门冬氨酸1.15g、谷氨酸1.97g、亚硫酸氢钠0.50g、木糖醇50.0g。

进一步，所述各原液均为注射级别的水溶液；其中所述生理盐水原液即为0.9％的氯化钠溶液。

优选地，所述运输保护液含有以体积百分比计的以下组分：

优选地，所述运输保护液中脐带间充质干细胞的浓度为2×10⁵-8×10⁵个/ml。

优选地，所述脐带间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。

优选地，制备得到的所述脐带间充质干细胞运输保护液需要在2-8℃避光环境下保存和运输，自分装之时起有效期为12小时。

进一步，本发明提供了一种脐带间充质干细胞运输保护方法，包括将所述脐带间充质干细胞以重悬方式调整加入到所述运输保护液中的步骤。

具体地，所述脐带间充质干细胞运输保护方法包括以下步骤：

①将脐带间充质干细胞的细胞悬液以700-900rpm的转速离心4-6分钟，吸弃上清液，加入一定量所述脐带间充质干细胞运输保护液，反复吹打，制得活细胞浓度为2×10⁵-8×10⁵个/ml的细胞悬液；

②将调整后的含有脐带间充质干细胞的运输保护液进行封装保存并运输，运输中的保存温度为2-8℃。

步骤①中，将活细胞浓度调整为2×10⁵-8×10⁵个/ml的具体方法为：吸取少量细胞悬液，用以进行细胞计数和细胞活力检测，舍弃死细胞，计数活细胞，若活细胞浓度为2×10⁵-8×10⁵个/ml，则调整完成，否则再加入所述运输保护液进行细胞数调整。

步骤①中，所述细胞计数和细胞活力检测是将细胞悬液和0.4％的台盼兰溶液按1:1混合，混匀1分钟后，在显微镜下用血球计数板计数细胞；活细胞排斥台盼兰，染成蓝色的细胞是死细胞。

优选地，步骤①中离心转速为800rpm，离心时间为5分钟。

优选地，步骤②中的保存环境为避光，保存时间为不超过12小时。

进一步，所述脐带间充质干细胞运输保护方法还包括脐带间充质干细胞的获取步骤：

1)从培养有第3-5代脐带间充质干细胞的培养瓶中吸弃原有培养基；

2)用磷酸缓冲液清洗培养的脐带间充质干细胞，并吸弃洗液；

3)加入胰酶-edta，37℃孵育2-3分钟，在倒置显微镜下观察细胞，直至脐带间充质干细胞完全消化下来，加入含血清的培养基终止消化；

4)加入磷酸缓冲液，反复吹打，制得细胞悬液。

本发明具有以下有益技术效果：

1、本发明的脐带间充质干细胞运输保护液稳定性高，便于保存和远距离运输，使用更安全，能够为临床上使用；

2、本发明的脐带间充质干细胞运输保护液能保证细胞的活力和稳定性，能够在体内有效发挥作用，防止克隆恩氏病的反复发作，解决了无法转移的病患在当地接受外地生产细胞制剂治疗疾病的难题，大大提供了疾病的治愈率。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明实施例中培养的贴壁人脐带间充质干细胞在显微镜下的照片；

图2是本发明实施例中在运输保护液中悬浮的人脐带间充质干细胞在显微镜下的照片；

图3是远距离运输12小时后，生理盐水与实施例1、2、3中活细胞数量的比较图，对照组为未经运输的细胞。

具体实施方式

下面详细说明本发明的实施例。

本发明所述脐带间充质干细胞运输保护液由复方氨基酸原液、5％的葡萄糖原液、生理盐水原液、1％的维生素c原液及0.1g/ml的edta二钠原液组成。

其中，所述复方氨基酸原液的组分为每升原液含：精氨酸盐酸盐2.89g、组氨酸盐酸盐2.46g、亮氨酸3.795g、异亮氨酸1.70g、赖氨酸盐酸盐3.33g、苯丙氨酸2.83g、苏氨酸1.97g、缬氨酸1.36g、蛋氨酸1.06g、色氨酸0.39g、甘氨酸3.24g、丙氨酸1.88g、脯氨酸1.00g、酪氨酸0.11g、丝氨酸0.67g、盐酸半胱氨酸0.44g、门冬氨酸1.15g、谷氨酸1.97g、亚硫酸氢钠0.50g、木糖醇50.0g。在本发明的实施例中采用辰欣药业股份有限公司生产的国药准字为h20057116的复方氨基酸原液配制所述运输保护液。

上述各原液均为注射级别的水溶液；其中所述生理盐水原液即为0.9％的氯化钠溶液。

实施例1

脐带间充质干细胞运输保护液配方如下(体积百分比)：

实施例2

脐带间充质干细胞运输保护液配方如下(体积百分比)：

实施例3

脐带间充质干细胞运输保护液配方如下(体积百分比)：

所述脐带间充质干细胞运输保护方法，包括以下步骤：

1)取培养有第3-5代人脐带间充质干细胞的培养瓶，培养的贴壁人脐带间充质干细胞的显微照片如图1所示；

2)用酒精棉球擦拭培养瓶盖口四周，然后旋开瓶盖，吸弃培养瓶中原有培养基，每瓶用10ml的磷酸缓冲液清洗两次，吸弃洗液；

3)每瓶中加入1ml胰酶-edta，放入37℃孵箱中孵育2-3分钟，在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保人脐带间充质干细胞完全消化下来，每瓶中加入1ml含血清的培养基终止消化；

4)每瓶中加入10ml的磷酸缓冲液，反复吹打，制得细胞悬液；

5)将细胞悬液移入离心管中，以800rpm的离心速度离心5分钟，离心结束，吸弃上清，获得人脐带间充质干细胞；

6)加入2-6毫升所述运输保护液，反复吹打，制得细胞悬液，其显微照片如图2所示；

7)吸取少量细胞悬液，用以进行细胞计数和细胞活力检测，舍弃死细胞，计数活细胞，若活细胞浓度为2×10⁵-8×10⁵个/ml，则调整完成，否则再加入所述运输保护液进行细胞数调整；其中，所述细胞计数和细胞活力检测是将细胞悬液和0.4％的台盼兰溶液按1∶1混合，混匀1分钟后，在显微镜下用血球计数板计数细胞；活细胞排斥台盼兰，染成蓝色的细胞是死细胞；

8)将调整后的含有2×10⁵-8×10⁵个/ml浓度的人脐带间充质干细胞的运输保护液进行封装保存并运输，运输中的保存温度为2-8℃。

将上述实施例1、2、3中的运输保护液及生理盐水在2-8℃避光环境下保存和运输人脐带间充质干细胞12小时之后，对细胞活性进行检测，将活细胞数量进行比较，并以未经运输的细胞作为对照，获得图3所示的结果。可见，实施例1、2、3中的活细胞数量是生理盐水中活细胞数量的3倍以上，本发明的脐带间充质干细胞运输保护液能保证细胞的活力，在远距离运输后很好的保持了细胞的效用。

本发明提供的脐带间充质干细胞运输保护液，该脐带间充质干细胞以重悬方式调整加入到脐带间充质干细胞运输保护液中，运输保护液中人脐带间充质干细胞的浓度为2×105-8×105个/ml。稳定性高，便于保存和远距离运输，使用更安全，能够为临床上使用。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。