一种快速繁殖水曲柳胚性细胞的方法与流程

本发明涉及一种快速繁殖水曲柳胚性细胞的方法，属于细胞工程技术领域。

背景技术：

水曲柳(fraxinusmandschuricarupr.)木犀科，白蜡树属，高大落叶乔木。基本特征是：树皮厚，灰褐色，冬芽大，圆锥形，小枝粗壮，四棱形，叶痕节状隆起，半圆形。羽状复叶；叶柄近基部膨大，叶着生处具关节，纸质，叶片长圆形至卵状长圆形，叶缘具细锯齿，上面暗绿色，下面黄绿色，圆锥花序生于去年生枝上，先叶开放，花序梗与分枝具窄翅状锐棱；雄花与两性花异株，均无花冠也无花萼；雄花序紧密，花梗细短，花药椭圆形，花丝甚短，子房扁而宽，翅果大而扁，自然生长环境下15年到20年才开花结果实，4月开花，8-9月结果。

水曲柳是我国东北素有“三大硬阔”之称的珍贵树木之一，木材材质优良，纹理美观，广泛应用于各领域。据调查发现，水曲柳是基本用种子繁殖的苗木，近几年也有一些扦插繁殖。目前，在水曲柳皮中检测出秦皮乙素、秦皮甲素、秦皮素、白蜡树精等物质，水曲柳皮在民间被用于治疗风湿、类风湿性关节炎及骨痛病，疗效确切。但树木去皮后就会死亡，砍伐也会造成资源的浪费和破坏，不利于可持续发展。因此，利用细胞工程技术快速培养水曲柳细胞是解决这一问题的方法之一，可以为工厂化生产及次生代谢产物研究提供条件。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速繁殖水曲柳胚性细胞的方法。该方法可以明显促进水曲柳胚性细胞的分化，单细胞的形成及小细胞团的繁殖，从而为水曲柳胚性细胞的培育及工业化生产，次生代谢产物提取提供重要的技术支持。

为了达到上述目的，本发明选取水曲柳的愈伤组织，该愈伤组织的诱导来源可以是根、茎、叶、种子、胚等多种外植体。将愈伤组织接入f4固体培养基中，经过1-2个继代的培养(每个继代20天左右)，可以获得胚性愈伤组织，再选取松散的胚性愈伤组织进行扩繁就可以获得大量的胚性细胞。选取松散的胚性细胞接入f4液体培养基，经过2-3个继代的震荡培养(每个继代15天左右)，即可获得单细胞和小细胞团的混合细胞，经过细胞筛过滤就可分离单细胞和小细胞团。

一种快速繁殖水曲柳胚性细胞的方法，关键点在于选用f4培养基，该培养基既可以是固体培养基也可以是液体培养基。

一种快速繁殖水曲柳胚性细胞的技术方法所用的f4培养基，包括以下成分：

(1)f4固体培养基：包括基础培养基，激素，蔗糖，琼脂。

基础培养基选自wpm培养基，成分包括nh4no3400mg/l，kh2po4170mg/l，k2so4990mg/l，mgso4·7h2o370mg/l，ca(no3)2·4h2o556mg/l，cacl2·2h2o96mg/l，mnso4·4h2o22.5mg/l，znso4·7h2o8.6mg/l，cuso4·5h2o0.25mg/l，h3bo36.2mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，feso4·7h2o27.8mg/l，na2edta37.3mg/l，烟酸(vb3)0.5mg/l，vb11mg/l，vb60.5mg/l，甘氨酸2mg/l，肌醇(通用)100mg/l。

激素选择ba、naa、tdz、iba四种激素，含量范围ba0.5-1.5mg/l、naa0.05-0.2mg/l、tdz0.1-0.5mg/l、iba0.1-0.5mg/l。

蔗糖含量为10-80g/l，琼脂3.0-6.8mg/l。

(2)f4液体培养基：包括基础培养基，激素，蔗糖。

基础培养基选自wpm培养基，成分包括nh4no3400mg/l，kh2po4170mg/l，k2so4990mg/l，mgso4·7h2o370mg/l，ca(no3)2·4h2o556mg/l，cacl2·2h2o96mg/l，mnso4·4h2o22.5mg/l，znso4·7h2o8.6mg/l，cuso4·5h2o0.25mg/l，h3bo36.2mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，feso4·7h2o27.8mg/l，na2edta37.3mg/l，烟酸(vb3)0.5mg/l，vb11mg/l，vb60.5mg/l，甘氨酸2mg/l，肌醇(通用)100mg/l。

激素选择ba、naa、tdz、iba四种激素，含量范围ba0.5-4.0mg/l、naa0.05-0.4mg/l、tdz0.1-0.6mg/l、iba0.1-2.0mg/l。

蔗糖含量为10-80g/l。

附图说明

图1：f4固体培养条件下的水曲柳胚性细胞

图2：f4液体培养条件下的水曲柳单细胞及小细胞团

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明采用wpm为基础培养基，添加30g/l的蔗糖，4种不同浓度的激素：

固体培养基：wpm基本培养基+蔗糖30g/l+ba+naa+tdz+iba+琼脂4.5g/l，ph值5.8-6.0；

液体培养基：wpm基本培养基+蔗糖30g/l+ba+naa+tdz+iba，ph值5.8-6.0；

激素浓度见下表1：

表1激素浓度

本发明按照以下步骤进行：

蔗糖浓度的优化：

添加不同浓度的蔗糖，蔗糖浓度为10g/l、20g/l、30g/l、60g/l、80g/l，培养20d，收取细胞，称量其生长量。按照蔗糖的浓度，细胞干重的生长率变化为30g/l>20g/l>10g/l>60g/l>80g/l，因此，选择蔗糖为30g/l进行细胞培养。

固体培养：

(1)选取水曲柳愈伤组织；

(2)在无菌条件下，将愈伤组织接入f类固体培养基中，置于组培室，昼夜光照周期培养条件为：白天光照强度为2000-3000lux，光照时间12-14h/d，温度25±1℃；夜间温度18±1℃；20d左右继代一次，经过1-2个继代，观察实验结果；

(3)经过结果统计，在f1-9中，f4培养基上的细胞涨势最快，胚性愈伤组织较多，基本达到90％以上，f5-6培养基上的细胞涨势也可以，胚性愈伤组织也能达到70-80％，但与f4培养基上的细胞相比较低，因此，选择f4做为水曲柳胚性愈伤组织的繁殖培养基，该培养基已经经过7-8个继代的应用，细胞涨势依然旺盛，不会出现褐化死亡的现象。

液体培养：

(1)选取在f4固体培养基中涨势松散的活力旺盛的愈伤组织。

(2)将松散愈伤组织在无菌条件下接种于f4液体培养基中，

(3)在无菌条件下，用细胞筛过滤单细胞和小细胞团，分别放入f4液体养基中培养，即可获得水曲柳单细胞和胚性细胞团。

(4)也可以将(3)过滤的细胞接种在f4固体培养基中，10d左右可见新鲜细胞长出。

本发明通过对水曲柳胚性愈伤组织、单细胞和小细胞团的培养体系的优化，筛选出促使水曲柳愈伤和细胞快速繁殖的培养体系，为规模化生产及次生代谢产物的生产提供了技术支持。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

与现有技术相比，本研究选择水曲柳不同来源的愈伤组织，进行固体和液体不同培养方式的技术优化，选出无论在何种方式下都能快速生长的培养基，为后期利用生物反应器培养及工业化生产奠定了基础，同时，本发明也为后期研究水曲柳次生代谢产物提供了条件。