用含内源菌的水稻种子培养水稻无菌愈伤的方法与流程

本发明涉及到分子生物学和农业技术领域，具体涉及一种用含内源菌的水稻种子培养水稻无菌愈伤的方法。

背景技术

水稻作为中国乃至世界非常重要的粮食作物之一，在中国稻谷产量几乎占粮食总产量的一半。历年来，育种家和农业技术专家致力于提高水稻产量和提高水稻抗性，实现了一个又一个目标。但随着人口不断增加和经济水平的提高，培育产量更高、耐受性更好、营养更加丰富的水稻新品种是需要不断探索和追求的目标，需要在育种方面不断地进一步发展。在育种过程中，一些非常珍贵的种质资源因种植时间等原因就会在存储过程中出现携带各种菌的现象，造成在种子愈伤组织培养过程中出现不同于操作染菌的情况，由种子内部而发、围绕种子长成菌落的染菌情况，这对于愈伤组织培养影响非常大，非常有必要对含有内源性菌的种质进行抢救性培养。目前少有对含有内源菌水稻种子愈伤培养的方法，常规的方法无法培养得到无菌愈伤组织。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用含内源菌的水稻种子培养水稻无菌愈伤的方法。

本发明的技术方案概述如下：

用含内源菌的水稻种子培养水稻无菌愈伤的方法，包括如下步骤：

(1)将含内源菌的水稻种子于日光下暴晒2-3天；

(2)用无菌水冲洗2-3次，于无菌台内吹干；

(3)用体积浓度75％乙醇水溶液浸泡4-5min，取出，用无菌水冲洗2-3次；

(4)在容器中，用蒸馏水稀释0.8倍的次氯酸钠溶液浸泡40-45min，每8-10min摇晃容

器，取出，用无菌水冲洗，于无菌台内吹干；

(5)在无菌台内，将步骤(4)获得的种子摆入装有nb基本培养基的培养瓶内；

(6)27-29℃暗培养，每隔3天，将没有染菌迹象的种子转移到新的nb基本培养基中；至长出愈伤，挑取愈伤于新的nb基本培养基中，在27-29℃暗培养，得到水稻无菌愈伤。

本发明的方法能快速用含有内源菌水稻种子获得无菌愈伤组织，不仅成本低、操作简单，而且在育种过程中节约种子，成本低、操作简单，能采对珍贵的种质资源进行抢救性培养。

附图说明

图1为种子上长出愈伤照片。

图2为继续培养得到的大量的水稻无菌愈伤照片。

具体实施方式

次氯酸钠溶液市售，以有效氯计10％。

含内源菌的水稻种子的签定：在水稻种子愈伤组织培养过程中会出现两种染菌现象：一种是由于没有严格控制好无菌操作而造成的染菌，一般染菌种类不确定，在培养基表面各部位长成菌落；另一种是水稻种子在存储过程中出现携带各种菌的情况，进而在水稻愈伤组织培养过程中出现由种子内部而发、围绕种子长成菌落的情况，此时水稻种子称为含有内源菌的水稻种子。

将津原香98水稻种子按照常规方式培养愈伤组织4次，总是出现由种子内部而发、围绕种子长成菌落的情况，而同批次其他水稻品种未出现围绕种子染菌这种情况，因此鉴定出所用津原香98水稻种子含有内源菌。

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明采用的水稻品种为津原香98水稻，市售。

实施例1

用含内源菌的水稻种子培养水稻无菌愈伤的方法，包括如下步骤：

(1)将含内源菌的水稻种子于日光下暴晒2.5天；

(2)用无菌水冲洗2次，于无菌台内吹干；

(3)用体积浓度75％乙醇水溶液浸泡5min，取出，用无菌水冲洗3次；

(4)在容器中，用蒸馏水稀释0.8倍的次氯酸钠溶液浸泡43min，每9min摇晃容器，取

出，用无菌水冲洗，于无菌台内吹干；

(5)在无菌台内，将步骤(4)获得的种子摆入装有nb基本培养基的培养瓶内；

(6)28℃暗培养，每隔3天，将没有染菌迹象的种子转移到新的nb基本培养基中；至长出愈伤(7天)(图1)，挑取愈伤于新的nb基本培养基中，在28℃暗培养，得到大量的水稻无菌愈伤(图2)。

实施例2

用含内源菌的水稻种子培养水稻无菌愈伤的方法，包括如下步骤：

(1)将含内源菌的水稻种子于日光下暴晒2天；

(2)用无菌水冲洗2次，于无菌台内吹干；

(3)用体积浓度75％乙醇水溶液浸泡4min，取出，用无菌水冲洗2次；

(4)在容器中，用蒸馏水稀释0.8倍的次氯酸钠溶液浸泡45min，每10min摇晃容器，

取出，用无菌水冲洗，于无菌台内吹干；

(5)在无菌台内，将步骤(4)获得的种子摆入装有nb基本培养基的培养瓶内；

(6)27℃暗培养，每隔3天，将没有染菌迹象的种子转移到新的nb基本培养基中；至长出愈伤(9天)，挑取愈伤于新的nb基本培养基中，在27℃暗培养，得到大量的水稻无菌愈伤。

实施例3

用含内源菌的水稻种子培养水稻无菌愈伤的方法，包括如下步骤：

(1)将含内源菌的水稻种子于日光下暴晒3天；

(2)用无菌水冲洗3次，于无菌台内吹干；

(3)用体积浓度75％乙醇水溶液浸泡5min，取出，用无菌水冲洗3次；

(4)在容器中，用蒸馏水稀释0.8倍的次氯酸钠溶液浸泡40min，每8min摇晃容器，取

出，用无菌水冲洗，于无菌台内吹干；

(5)在无菌台内，将步骤(4)获得的种子摆入装有nb基本培养基的培养瓶内；

(6)29℃暗培养，每隔3天，将没有染菌迹象的种子转移到新的nb基本培养基中；至长出愈伤(8天)，挑取愈伤于新的nb基本培养基中，在29℃暗培养，得到大量的水稻无菌愈伤。

nb基本培养基，配方如表1。

表1nb基本培养基

后加入2,4-d2mg/l，121℃灭菌20min。

n6大量(20×)

表2n6大量(20×)

(1)kno3,(nh4)2so4,kh2po4同时倒入烧杯，加水搅拌，使之完全溶解；

(2)mgso4.7h2o先溶于加了100ml水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中，边倒边搅，不能有沉淀；

(3)cacl2.2h2o的配制同mgso4.7h2o；

(4)配好后放于棕色瓶4℃保存。

b5微量(100×)

表3b5微量1(100×)

表4b5微量2(100×)

注：1中各试剂倒入烧杯，加水搅拌，使之完全溶解。2中各试剂单独配成母液，各取50ml加入1中，定容至500ml放于棕色瓶4℃保存

fe盐(100×)

表5fe盐(100×)

注：feso4溶于水，na2-edta溶于热水，混合定容，微波炉中加热，煮沸。颜色变深，冷却至室温，补水，棕色瓶4℃保存

b5有机(100×)

表6vb6(1000×)

表7vb3(1000×)

注：vb6、烟酸分别配成母液，各取50ml加入400ml水中，加入0.5gvb1，定容至500ml，配成有机母液。肌醇现用现加。

2,4-d2mg/l(100×)

0.1g2,4-d溶于500ul无水乙醇，加1nkoh溶解，定容至500ml。

以上内容为本发明创造的进一步具体说明，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。