冻存液及用于人体回输的CAR-T细胞冻存制剂的制作方法

本发明涉及细胞医疗技术领域，特别涉及一种冻存液及用于人体回输的car-t细胞冻存制剂。

背景技术：

chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy简称car-t，是指嵌合抗原受体t细胞免疫疗法，其基本原理是利用病人本身的免疫t细胞对癌细胞进行清除，流程主要包括：1、自病人体内分离免疫t细胞；2、通过基因工程技术对t细胞进行靶向修饰并同时激活t细胞的嵌合抗原，获得car-t细胞；3、体外培养，大量扩增car-t细胞；4、将扩增后的car-t细胞回输至病人体内。该法利用细胞的靶向治疗，对恶性的血液肿瘤(如急性白血病、非霍奇金淋巴瘤)有显著的治疗效果。但是，在治疗过程中，提取-制备-扩增获得car-t细胞的时间较长，在获得car-t细胞后，容易因治疗因素发生变化导致不能及时注射新鲜制剂。因此，如何使car-t细胞获得长期有效的保存是解决该问题的重要手段。

技术实现要素：

本发明的主要目的是提供一种冻存液，旨在可以使car-t细胞能够长期保存，使用更加灵活。

为实现上述目的，本发明提出的冻存液，用于car-t细胞的冷冻保存，含有以下成分：复方电解质注射液0～67.5％(v/v)、葡萄糖氯化钠注射液0～67.5％(v/v)、右旋糖酐40葡萄糖注射液0～20％(v/v)、人血白蛋白注射液20～30％(v/v)、二甲亚砜5～15％(v/v)；其中，所述人血白蛋白注射液中人血白蛋白含量为20％，所述复方电解质注射液含有氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁。

优选地，所述复方电解质注射液含有(质量浓度)：氯化钠0.526％、葡萄糖酸钠0.502％、醋酸钠0.368％、氯化钾0.037％、氯化镁0.03％。

优选地，所述冻存液含有成分：复方电解质注射液25～32.5％(v/v)、葡萄糖氯化钠注射液25～32.5％(v/v)、右旋糖酐40葡萄糖注射液10％(v/v)、人血白蛋白注射液25％(v/v)、二甲亚砜7.5％(v/v)。

本发明还提出一种用于人体回输的car-t细胞冻存制剂，包括car-t细胞和冻存液；冻存液用于car-t细胞的冷冻保存，含有以下成分：复方电解质注射液0～67.5％(v/v)、葡萄糖氯化钠注射液0～67.5％(v/v)、右旋糖酐40葡萄糖注射液0～10％(v/v)、人血白蛋白注射液20～30％(v/v)、二甲亚砜5～10％(v/v)；其中，所述人血白蛋白注射液中人血白蛋白含量为20％，所述复方电解质注射液含有氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁。

优选地，所述car-t细胞冻存制剂中car-t细胞的密度为1×10⁶/ml～2×10⁸/ml。

本发明技术方案通过采用复方电解质注射液、葡萄糖氯化钠注射液和右旋糖酐40葡萄糖注射液，使复方电解质注射液、葡萄糖氯化钠注射液和右旋糖酐40葡萄糖注射液在系统中共同作用，维持离子渗透压和胶体渗透压的系统平衡，形成有利于car-t细胞存活的环境条件，可用于car-t细胞的长期保存，对car-t细胞具有好的保存效果。并且，使用该冻存液与car-t细胞制备所得的car-t细胞冻存制剂，在冻存之后可用于人体回输，使用更加方便、灵活。

附图说明

图1为不同实施例car-t细胞冻存制剂在相同条件下获得的活细胞总数；

图2为不同实施例car-t细胞冻存制剂在相同条件下获得的活细胞率。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

一、冻存液

以下实施例采用的试剂来源：

复方电解质注射液：于1000ml水中加入氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g、氯化镁0.3g；或直接购自河北天成药业股份有限公司；

葡萄糖氯化钠注射液：葡萄糖含量为5％(质量浓度)、氯化钠含量为0.9％(质量浓度)，购自四川科伦药业股份有限公司；

右旋糖酐40葡萄糖注射液：右旋糖酐40含量为6％(质量浓度)，葡萄糖含量为5％(质量浓度)，购自石家庄四药有限公司；

人血白蛋白注射液：人血白蛋白含量为20％，购自瑞士杰特贝林生物制品有限公司；

二甲基亚砜：wak-chemiemedicalgmbh。

根据冻存液含有的组成成分，采用不同的比例以得到不同的实施例，请参见表一：

表一不同实施例中的各组分比例

根据上述实施例中的组成成分比例，将各组分按照比例均匀混合，即得到不同比例的冻存液。

二、本发明还提出一种用于人体回输的car-t细胞冻存制剂

该用于人体回输的冻存制剂包括car-t细胞和冻存液，冻存液的实施方式可参照上述具体实施例，在此不再赘述。其中，car-t细胞的密度为1×10⁶/ml～2×10⁸/ml。

为验证该用于人体回输的car-t细胞冻存制剂中冻存液对car-t细胞的保护效果，以car-t细胞密度为1.1×10⁸/ml为例，采用不同配方的冻存液制备获得不同的用于人体回输的car-t细胞冻存制剂，具体步骤如下：

1、选取表一中的实施例六至十，使各组分按照比例均匀混合，得到不同比例的冻存液，并分别进行标记为a、b、c、d、e，备用。

2、将car-t细胞转移至离心管中，在500g的条件下离心10min，去掉上清液，加入0.9％氯化钠溶液重悬，重复操作一次；采用台盼蓝法对car-t细胞进行计数，分别取5支50ml离心管，对应标记为a、b、c、d、e，每支离心管中装入6.0×10⁸个细胞，在500g的条件下离心10min，去掉上清液，每支离心管中分别加入一定量的冻存液将car-t细胞的密度稀释调整至1.1×10⁸/ml，用细胞仪检测确认；

3、对应每一个编号取三支冻存管并按序编号，分别取同体积的样品对应加入至冻存管中，程控降温后，放置于液氮中保存。在液氮中冻存48h后将样品取出，于37℃水浴中复苏。摇晃均匀后，每份样品取50μl于15ml离心管中，加入9.95mlx-vivo培养基稀释，混合均匀。

每份混合均匀的样品通过采用细胞仪检测可得活细胞数、死细胞数，从而得到对应的用于人体回输的car-t细胞冻存制剂中的活细胞密度和细胞活率，以反映冻存液对细胞的保护效果。具体实验结果参见表二。

n活：活细胞数目；

n死：死细胞数目；

表二细胞密度为1.1×10⁸/ml的不同car-t细胞冻存制剂在液氮中冻存48h后的复苏实验结果

根据表二中实验数据，结合附图1和附图2可知，本发明用于人体回输的car-t细胞冻存制剂中的冻存液对car-t细胞均具有较好的保护效果。尤其是当冻存液中同时含有复方电解质注射液25～32.5％(v/v)、葡萄糖氯化钠注射液25～32.5％(v/v)和右旋糖酐40葡萄糖注射液10％(v/v)的情况下，冻存后的细胞活率可达到80％以上。这是因为，复方电解质注射液、葡萄糖氯化钠注射液和右旋糖酐40葡萄糖注射液在系统中共同作用，使离子渗透压和胶体渗透压达到平衡，形成有利于car-t细胞存活的环境条件。

由此可以看出，采用本发明技术方案的冻存液，可用于对car-t细胞的长期保存，并对car-t细胞具有好的保护效果。并且，通过与car-t细胞制备所得的car-t细胞冻存制剂，在冻存之后可用于人体回输，使得使用更加方便、灵活。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。