一种牙类器官冻存方法与流程

本发明属于生物技术领域，尤其涉及到一种牙类器官冻存方法。

背景技术：

体外冻存技术目前已广泛应用于细胞研究领域，但目前对于器官培养的冻存研究尚无大量文献报导。牙齿的外层由牙本质、牙釉质和牙骨质等硬组织包绕，内部则为牙髓软组织，是一个特化的器官。对于这种兼具软硬组织的器官，体外冻存是具有挑战性和难度。

从发育学的角度看，器官发育是一个动态的整体，任何器官的发育都离不开周围的环境，而另一方面，器官本体周围的环境也在同时进行发育，随时产生变化，这也强调了发育的复杂性和发育学研究的难点。全牙的保存之所以困难，主要是因为牙体硬组织阻挡了冻存保护液向髓腔内渗透，牙髓的活力在冻存后通常难以保留，牙髓组织会发生不同程度的变性，坏死。牙齿外层硬质材料无法渗透营养液，也决定了牙胚不好增育。

比如对大鼠切牙进行冻存，其冠部2/3牙髓几乎全部丧失活力，而根尖1/3部分的牙髓可保存较高的活性。体外冻存人类三磨牙，结果也显示根尖1/3的牙髓成纤维细胞有较强的活力，根中1/3的细胞活力下降，冠髓则未见成纤维细胞。

目前关于牙再生研究主要有两种：1、基于发育学原理，通过诱导具有成牙潜能的上皮与间充质细胞，重组牙胚或牙胚类器官，使二者再相互诱导发育形成牙体组织；2、利用组织工程原理，在体外复合干细胞，生长因子与支架材料，分别构建牙体硬组织，牙周组织与牙髓组织，再组合构建组织工程牙。

牙胚重组和组织工程牙的构建都存在诸多限制：重组牙胚需要具有成牙能力的上皮或者间充质细胞来诱导重组体定向发育，但胚胎期的牙胚难以获取，几乎不可能实现，而胚胎干细胞，诱导多能干细胞的研究目前还不够成熟，难以对其精确地定向诱导。对于组织工程牙，成体干细胞的选取和诱导，生物支架材料的选择和制备，都还需要通过大量实验的摸索优化，距广泛临床应用尚还有一定距离。

自体牙移植相较上述两种方法来说，其在临床上已有使用，具有一定优势。预防性拔除智齿和因正畸需求拔除的牙齿均可作为供体牙来源。自体牙移植还可规避诸如免疫排斥、伦理等临床应用问题。但其适应范围相对受限，需要牙缺失患者自身同时具备合适的供体牙来源。有人为解决这个问题，尝试对牙齿在体外进行冻存，旨在拓宽其适应证，但保存后的牙齿活力难以维持,发育能力弱或失去。

因此，自体牙移植和牙再植术在临床上尚不甚成熟。

目前如何将冻存牙类作为一种医疗资源使用，且又能再发育，又具有高活性和发育能力，这是现在所需要的。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供一种牙类器官冻存方法，将发育中的器官进行冻存，冻存后能继续发育成成熟器官，且有着高的活性和发育能力；冻存方法操作简便，重复性好，并容易进行推广。

牙类器官：牙发育过程中一定时期的牙胚；或利用多能干细胞或成体干细胞，模拟体内牙发育模式，通过干细胞自组装和定向分化，体外三维培养形成具有一定结构和功能的牙胚类似物。

解决以上技术问题的一种类牙器官冻存方法，其特征在于：

(1)获取供体牙类器官；

(2)牙类器官放于装有培养基的容器中浸泡，静置8-12min，再将容器置于冷冻条件下保存12～36h后转移至液氮中保存；使冻存保护液渗透进入到硬组织包裹的牙乳头中，从而使牙乳头在复苏后保留了良好的活性，继续发育成为牙髓牙本质复合体。

(3)使用时将容器置于37-40℃水浴中解冻复苏；

(4)取出牙类器官，用pbs缓冲液洗涤，再放入pbs缓冲液或生理盐水中浸泡待用。洗涤可洗涤2次。

在已获得供体牙来源后，供体牙单位在体外的培养和保存将成为决定牙移植与牙再生适应证范围的重要因素。

所述步骤(2)中培养基为含质量百比为8～12％二甲基亚砜(dmso)的bgjb培养基；冷冻温度为-70～-80℃。dmso为冻存保护剂。

所述容器置于-80℃条件下保存24h；所述液氮浓度≥98％；所述二甲基亚砜的质量百分比浓度为10％。

进一步优化方案中，所述牙胚为上颌第一磨牙牙胚或第二磨牙牙胚，优选为上颌第一磨牙牙胚。在一个牙根尚未形成，根方无硬组织遮挡的时间点，尝试将牙胚进行体外保存。此外，即便对于重组牙类器官和组织工程牙而言，为了将来更进一步地临床转化应用，体外的冻存培养也是十分具有意义的。也利用牙根尚未开始发育，根方尚无硬组织的牙胚进行冻存，并尝试将牙胚资源化。

本发明中牙胚在历经冻存后仍然能够发育出生理牙根。牙根的功能是否能够得以保留关系着整个牙齿的命运。冻存保护液可渗透进入到硬组织包裹的牙乳头中，从而使牙乳头在复苏后保留了良好的活性，继续发育成为牙髓牙本质复合体。

出生后第八天的小鼠上颌第一磨牙牙胚处于钟状末期，根方为软组织，利于培养液的液体交换。牙胚在历经冻存后仍然能够发育出生理牙根，不即作为一种资源进行收集和保存外，还为将来组织工程牙或者体外类器官的构建提供了实验基础。

所述牙胚为小鼠右侧上颌第一磨牙牙胚。

所述牙胚处于钟状末期，牙根尚未发育，根方敞开，根面为牙乳头软组织，且牙根的发育即将开始。

出生后第八天的小鼠上颌第一磨牙处于钟状末期，牙根尚未发育，根方敞开，根面为牙乳头软组织，且牙根的发育即将开始。其形态特点适合作为移植手术的研究对象：第一，取出时不存在牙根的阻力，易于脱位；第二，其为椭圆形，能够很好地适应牙槽窝形态；第三，根面为软组织，利于培养液的液体交换，可作为体外器官培养的对象；第四，其具有牙根发育潜能，可在移植术后观察到整个牙根发育的过程。理论上，越早期的牙胚发育潜能越强，但从实验的可操作性上，较大的乳鼠更易于操作且对手术创伤的耐受力更强，存活率更高。

出生后十天的小鼠上颌第二磨牙，位置较深，操作视野及空间更为受限，但仍可进行操作；体积较小，大约为第一磨牙的一半，相较于第一磨牙的类平行四边形形态，其更趋近于不规则球形，故拔除阻力小，易于脱位。

所述步骤(1)中获取供体牙类器官的方式为建立动物模型，即小鼠钟状末期类牙器官的拔除模型。

所述冻存方法还包括牙类器官的移植模型步骤，使符合移植要求的牙类器官存活率高。

采用一些方法尝试牙再生，需要在牙槽骨中原位移植牙槽骨进行验证。在此之前，评估上皮-间充质重组体的发育状况、组织工程牙的再生能力或自体牙的活力保存情况重点步骤，确认移植牙的牙根能够继续生长发育并与牙槽骨形成稳固的牙周附着关系，以确保其可能行使功能。本发明中小鼠钟状末期上颌第一磨牙牙胚的拔除与移植模型对这些进行了合适的评估。采用正在发育的颌骨作为载体，将牙胚置于其中进行观察研究，其发育过程必将最接近于生理条件下的牙齿发育过程，可以为以后实现临床功能性牙再生提供条件。

本发明中小鼠钟状末期上颌第一磨牙牙胚的拔除与移植模型，重复性好，稳定可靠，包括步骤如下：

(1)获取牙胚、小鼠上颌离体第一磨牙并观察：牙胚浸泡于等渗pbs缓冲液中，即刻体视显微镜观察；上颌第一磨牙用4％多聚甲醛固定过夜，10％edta溶液脱矿8天，包埋切片，h&e染色观察。小鼠为出生后第八天及第十天小鼠。

(2)出生后第八天小鼠上颌第一磨牙的拔除：麻醉与固定，术野的暴露及口内术区观察，切口，翻瓣，骨切开，取出牙胚；

(3)出生后第八天小鼠上颌第一磨牙的原位移植：供体牙胚的获取及牙胚的移植；

剥除牙槽骨上的粘骨膜后，自牙槽嵴顶无骨质区分别向颊腭侧剥离骨质，暴露牙冠，将牙胚向颊侧轻推脱位，由底部轻轻端起牙胚，浸泡于无菌pbs缓冲液中备用；

取供体牙胚轻放在拔牙窝远中的牙槽嵴上，调整方向使牙胚长轴平行于牙槽嵴方向，颌面向上，牙尖组倾向远中。轻推牙胚使之从远中向近中斜向牙槽窝内就位(图5，a、b)，仔细检查是否就位完全后，复位腭粘骨膜瓣；

(4)移植后评估：剥离上颌骨，4％多聚甲醛(ph＝7)固定过夜，pbs缓冲液洗涤浸泡；microct扫描、浸泡于10％edta溶液中进行脱矿，梯度脱水，石蜡包埋，切片和h&e染色。

所述供体牙胚的获取：取同日龄安乐死后的小鼠头颅，剪除下颌及舌体，置于体视显微镜下取材。剥除牙槽骨上的粘骨膜后，自牙槽嵴顶无骨质区分别向颊腭侧剥离骨质，暴露牙冠，将牙胚向颊侧轻推脱位。由底部轻轻端起牙胚，浸泡于无菌pbs缓冲液中备用，切忌用力夹持。与制备拔牙窝相反的是，整个取材过程应注重保护牙胚，尽量通过多去除牙槽骨的方法使牙胚轻松脱位。

所述牙胚的原位移植：取供体牙胚轻放在拔牙窝远中的牙槽嵴上，调整方向使牙胚长轴平行于牙槽嵴方向，颌面向上，牙尖组倾向远中。轻推牙胚使之从远中向近中斜向牙槽窝内就位，仔细检查是否就位完全后，复位腭粘骨膜瓣。

本发明中所述快速解冻复苏即将冻存管放在里面晃荡，直到冰块完全溶解即可。

本发明中体外冻存的方法来保存牙类器官，在患者需要的时候再行复苏移植，以减少甚至消除自体移植的时间依赖性。比如牙胚可以通过体外冻存得以长期保留，则可以利用移植冻存复苏后的自体牙胚的方法来解决单个磨牙缺失问题。

附图说明

图1为本发明中两种移植模型的比较图(标尺＝500μm)

图2为本发明中的两种移植方模型后三周的microct图像

(a.肾被膜下移植术后；b.牙槽窝原位移植术后；标尺＝500μm)

图3为本发明中牙根长度的测量图

(其中，a.为水平面观；以釉牙本质界为参考，在牙颈部设置一个基准平面(红色箭头示牙釉质)；b.为矢状面观；标注水平面上牙根到参考平面的最远点(红点)，该点所在平面与基准平面的距离为牙根长度；标尺＝500μm)

图4为本发明中牙术后牙齿萌出的评估图

(其中，m1.示上颌第一磨牙，m2示上颌第二磨牙；食物残渣已去除；a.完全未萌出；b.小部分萌出，萌出部分牙合面面积小于总牙合面面积的1/2；c.大部分萌出，萌出部分牙合面面积大于总牙合面面积的1/2；d.完全萌出，为生理牙胚对照组；标尺＝1mm)

图5为本发明中各组术后3周样品的microct观察及牙根长度统计分析图

(其中，a.生理牙胚组；b.新鲜牙胚移植组；c.冻存1周牙胚移植组；d.冻存4周牙胚移植组；e.冻存12周牙胚移植组；f.各组牙根长度的统计分析；*p<0.005。标尺＝1mm)

图6冠部炎性纤维组织及吸收陷窝图

(其中，a.牙冠部出现炎性纤维组织，b,c为红色虚线框内高倍镜下观，b.牙釉质表面见吸收陷窝，c.牙本质表面见吸收陷窝；箭头示含多个核的细胞；标尺＝100μm)

图7各组术后1、2、3周样品上颌第一磨牙的h&e染色图

(其中，a-c.生理牙胚组，d-f.新鲜牙胚移植组，g-i.冻存1周牙胚移植组，j-l.冻存4周牙胚移植组，m-o.冻存12周牙胚移植组，a,d,g,j,m术后1周，b,e,h,k,n术后2周，c,f,i,l,o.术后3周；标尺＝100μm)

具体实施方式

下面用具体实施方式来对本发明内容人进一步的说明：

其中，所用材料、试剂、仪器设备和动物如下：

固定用木板，丝线，医用剪刀，镊子，显微镊，手术刀片，手术刀柄，显微镊，异氟烷，氯化美托咪定，咪达唑仑，酒石酸布托啡诺，等渗pbs缓冲液，1ml注射器，棉签，体视显微镜，光纤光源机，组织切片机(leica，德国)，microct机(scanxmate-e090；comscantecnoco.,ltd.,yokohama,日本)，bgjb培养基，二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,dmso)，冻存管，程序降温冻存盒，液态氮，液氮罐，4％多聚甲醛溶液，10％edta溶液，石蜡，各浓度乙醇，柠檬烯，苏木素和伊红染液以及c57bl/6小鼠(japanslc,inc.,hamamatsu,日本)。以上材料、试剂、仪器和动物均由divisionofcraniofacialdevelopmentandregeneration,graduateschoolofdentistry,tohokuuniversity提供。

实施例1

一种牙类器官冻存方法，具体步骤如下：

(1)获取供体牙类器官；牙类器官可为牙胚。

(2)牙类器官放于装有培养基的容器中浸泡，静置8min，再将容器置于冷冻条件下保存12h后转移至液氮中保存；培养基为含质量百分比为8％二甲基亚砜的bgjb培养基；冷冻温度为-70℃；液氮浓度≥98％。

(3)使用时将容器置于37℃水浴中快速解冻复苏；

(4)取出牙类器官，用pbs缓冲液洗涤，再放入pbs缓冲液或生理盐水中浸泡待用。洗涤可洗涤2次。

容器置于-80℃条件下保存24h；所述；二甲基亚砜的质量百分比浓度为10％。

获取供体牙类器官的方式为建立动物模型，即小鼠钟状末期类牙器官的拔除模型

本发明中冻存方法还包括牙类器官的移植模型步骤，使符合移植要求的牙类器官存活率高。

采用方法尝试牙再生，需要在牙槽骨中原位移植牙槽骨进行验证。在此之前，评估上皮-间充质重组体的发育状况、组织工程牙的再生能力或自体牙的活力保存情况重点步骤，确认移植牙的牙根能够继续生长发育并与牙槽骨形成稳固的牙周附着关系，以确保其可能行使功能,这也就意味着需要一个合适模型来进行评价。

实施例2

一种牙类器官冻存方法，具体步骤如下：

(1)获取供体牙类器官；牙类器官可为上颌第一磨牙牙胚。利用牙根尚未开始发育，根方尚无硬组织的牙胚进行冻存，并尝试将牙胚资源化。牙胚在历经冻存后仍然能够发育出生理牙根。冻存保护液可渗透进入到硬组织包裹的牙乳头中，从而使牙乳头在复苏后保留了良好的活性，继续发育成为牙髓牙本质复合体。

(2)牙类器官放于装有培养基的容器中浸泡，静置12min，再将容器置于冷冻条件下保存36h后转移至液氮中保存；培养基为含12％二甲基亚砜的bgjb培养基；冷冻温度为-75℃；液氮浓度≥98％。

(3)使用时将容器置于40℃水浴中快速解冻复苏；

(4)取出牙类器官，用pbs缓冲液洗涤，再放入pbs缓冲液或生理盐水中浸泡待用。洗涤可洗涤2次。

容器置于-80℃条件下保存24h；所述二甲基亚砜的质量百分比浓度为10％。

获取供体牙类器官的方式为建立动物模型，即小鼠钟状末期类牙器官的拔除模型

本发明中冻存方法还包括牙类器官的移植模型步骤，使符合移植要求的牙类器官存活率高。

采用方法尝试牙再生，需要在牙槽骨中原位移植牙槽骨进行验证。在此之前，评估上皮-间充质重组体的发育状况、组织工程牙的再生能力或自体牙的活力保存情况重点步骤，确认移植牙的牙根能够继续生长发育并与牙槽骨形成稳固的牙周附着关系，以确保其可能行使功能,这也就意味着需要一个合适模型来进行评价。

实施例3

一种牙类器官冻存方法，具体步骤如下：

(1)获取供体牙类器官；牙类器官可为上颌第一磨牙牙胚，利用牙根尚未开始发育，根方尚无硬组织的牙胚进行冻存，并尝试将牙胚资源化。

出生后第八天的小鼠上颌第一磨牙牙胚处于钟状末期，根方为软组织，利于培养液的液体交换。本发明中牙胚在历经冻存后仍然能够发育出生理牙根，牙胚可作为一种资源进行收集和保存外，也可为将来组织工程牙或者体外类器官的构建提供实验基础。

(2)牙类器官放于装有培养基的容器中浸泡，静置10min，再将容器置于冷冻条件下保存24h后转移至液氮中保存；培养基为含10％二甲基亚砜的bgjb培养基；冷冻温度为-80℃。

(3)使用时将容器置于38℃水浴中快速解冻复苏；

(4)取出牙类器官，用pbs缓冲液洗涤，再放入pbs缓冲液或生理盐水中浸泡待用。洗涤可洗涤2次。

出生后第八天的小鼠上颌第一磨牙处于钟状末期，牙根尚未发育，根方敞开，根面为牙乳头软组织，且牙根的发育即将开始。其形态特点适合作为移植手术的研究对象。比如取出时不存在牙根的阻力，易于脱位；其为椭圆形，能够很好地适应牙槽窝形态；根面为软组织，利于培养液的液体交换，可作为体外器官培养的对象；其具有牙根发育潜能，可在移植术后观察到整个牙根发育的过程。理论上，越早期的牙胚发育潜能越强，但从实验的可操作性上，较大的乳鼠更易于操作且对手术创伤的耐受力更强，存活率更高。故综合考虑，本发明将出生后第八天的小鼠作为研究对象。

获取供体牙类器官的方式为建立动物模型，即小鼠钟状末期类牙器官的拔除模型

本发明中冻存方法还包括牙类器官的移植模型步骤，使符合移植要求的牙类器官存活率高。

采用方法尝试牙再生，需要在牙槽骨中原位移植牙槽骨进行验证。在此之前，评估上皮-间充质重组体的发育状况、组织工程牙的再生能力或自体牙的活力保存情况重点步骤，确认移植牙的牙根能够继续生长发育并与牙槽骨形成稳固的牙周附着关系，以确保其可能行使功能,这也就意味着需要一个合适模型来进行评价。

实施例4

(1)获取供体牙胚；牙胚为小鼠右侧上颌第一磨牙牙胚。牙胚处于钟状末期，牙根尚未发育，根方敞开，根面为牙乳头软组织，且牙根的发育即将开始。

(2)每一牙胚单独浸泡于1ml新鲜配制的含9％dmso的bgjb培养基中，静置8分钟后使用程序降温冻存盒置于-76℃冰箱中过夜，次日将冻存管转移至纯液氮中保存；

(3)牙胚保存1周后，置于39℃水浴中快速解冻复苏，pbs缓冲液洗涤2次后浸泡待用。

实施例5

(1)获取供体牙胚；牙胚为小鼠右侧上颌第一磨牙牙胚。

(2)每一牙胚单独浸泡于1ml新鲜配制的含11％dmso的bgjb培养基中，静置9分钟后使用程序降温冻存盒置于-75℃冰箱中过夜，次日将冻存管转移至液氮中保存；

(3)牙胚保存12周后，置于40℃水浴中快速解冻复苏，pbs缓冲液洗涤2次后浸泡待用。

以上实施例中，其中供体牙胚的获取、移植方法如下：

a、供体牙胚的获取：取同日龄安乐死后的小鼠头颅，剪除下颌及舌体，置于体视显微镜下取材。剥除牙槽骨上的粘骨膜后，自牙槽嵴顶无骨质区分别向颊腭侧剥离骨质，暴露牙冠，将牙胚向颊侧轻推脱位。由底部轻轻端起牙胚，浸泡于无菌pbs缓冲液中备用，切忌用力夹持。与制备拔牙窝相反的是，整个取材过程应注重保护牙胚，尽量通过多去除牙槽骨的方法使牙胚轻松脱位。

b、牙胚的原位移植：取供体牙胚轻放在拔牙窝远中的牙槽嵴上，调整方向使牙胚长轴平行于牙槽嵴方向，颌面向上，牙尖组倾向远中。轻推牙胚使之从远中向近中斜向牙槽窝内就位，仔细检查是否就位完全后，复位腭粘骨膜瓣。止血棉清洁口内，无需缝合。术后将乳鼠放回笼中由母鼠哺乳喂养。

c、牙的肾被膜下移植：出生后第八天小鼠上颌第一磨牙的肾被膜下移植。

其中麻醉与固定：取约8-10周龄的c57bl/6雄鼠称重，按照10ml/kg体重腹膜下注射0.5％戊巴比妥，待麻醉生效后，以小鼠左背部为中心备皮，取俯卧位，四肢固定于木板或泡沫板上。

牙胚移植：在小鼠左侧肋骨下缘下约0.5cm处作一1-1.5cm左右的平行于中线的纵行切口，对皮下组织稍作钝性分离，找到肋骨下缘与脊柱形成的夹角，透过肌层观察可见：靠近肋骨下缘为暗红色的肝左叶，向尾方可见以黄白色脂肪区域。左肾位于该脂肪区深面。

镊子提起脂肪区上方的肌层并剪破，钝性扩开，使大小稍小于肾的体积。拨开脂肪见粉红色的左肾，用小弯镊轻轻将其勾出肌层，将肾门部卡在肌层切口，使左肾固定于肌层之外。

显微镊提起肾被膜，用钝头玻璃探针轻轻刺破被膜并进入被膜下间隙，平行于间隙面向深部及左右分离松解被膜与肾实质表面。显微镊提起肾被膜，将牙胚置于被膜破口，钝头探针轻轻将其推入被膜下，显微镊夹持提起的肾被膜，使之覆盖牙胚，横过玻璃钝头探针隔着肾被膜将牙胚向深处推，确保其远离破口不易脱出。镊子提起肌层，轻推左肾使之复位，逐层缝合肌层和皮肤全层。

实施例5

本发明中小鼠钟状末期上颌第一磨牙牙胚的拔除与移植模型，重复性好，稳定可靠，具体步骤如下：

(1)出生后第八天及第十天小鼠上颌第一磨牙的观察：

取出生后第八天及第十天的小鼠行安乐死，取头颅，剪除下颌及舌体，置于体视显微镜下。剥除牙槽骨上的粘骨膜后，自牙槽嵴顶无骨质区分别向颊腭侧剥离骨质，暴露牙冠，将牙胚向颊侧轻推脱位。使用显微镊由牙胚底部轻轻将其端起，避免用力夹持，浸泡于等渗pbs缓冲液中，即刻体视显微镜观察。

取出生后第八天及第十天的的小鼠行安乐死后，取头颅，剪除下颌及舌体，剪去颅骨，剥离脑组织，沿中线对半切开，将两侧上颌组织固定于4％多聚甲醛溶液中固定过夜，10％edta(ph＝7.4)溶液脱矿约8天，脱矿液每2-3天更换一次。

组织梯度脱水及透明。75％乙醇，85％乙醇，95％乙醇(i)，95％乙醇(ii)，95％乙醇(iii)，100％乙醇(i)，100％乙醇(ii)，100％乙醇(iii)，二甲苯(i)，二甲苯(ii)，依次分别浸泡30-60分钟，63℃液体石蜡浸泡，每45-60分钟更换一次，更换四次后置于冷台包埋。

将样品沿矢状面切片，制备成5μm厚的组织切片，行h&e染色(hematoxylinandeosinstain,苏木素-伊红染色)。

h&e染色：

1)组织脱蜡：二甲苯(i)，二甲苯(ii)各5分钟；

2)组织复水：无水乙醇(i)，无水乙醇(ii)，95％乙醇(i)，95％乙醇(ii)，85％乙醇，75％乙醇，各1分钟；自来水浸泡，每次1分钟。

3)染色：苏木素染色2分钟，自来水3次，浸泡2次，每次1分钟；伊红染色2分钟，自来水洗3次，浸泡2次，每次1分钟。

4)组织脱水：75％乙醇，85％乙醇，95％乙醇(i)，95％乙醇(ii)无水乙醇(i)，无水乙醇(ii)，各1分钟。

5)透明及封片：二甲苯(i)，二甲苯(ii)，各5分钟，滴加适量中性树胶后盖玻片封片，室温通风过夜后显微镜下观察。

取出生后第八天的小鼠上颌离体第一磨牙，4％多聚甲醛固定过夜，10％edta溶液脱矿8天，包埋切片，h&e染色观察。

(2)出生后第八天小鼠上颌第一磨牙的拔除：

麻醉与固定

取出生后第八天的c57bl/6乳鼠称重(约为3-5g)，按照7ml/kg体重腹膜下注射0.5％戊巴比妥，待麻醉生效后，将小鼠面朝向施术者取仰卧位，双上肢用丝线固定在两侧有两枚钉子的方木板或泡沫板上，置于体视显微镜下。

右侧上颌第一磨牙的拔除：

1)术野的暴露及口内术区观察：

将光纤光源机置于体视显微镜左侧，弯曲光纤管，使光线分别由小鼠的左侧以及头侧照射至小鼠头部。手持显微镊使小鼠被动张口，并令舌体随下颌上抬，可见切牙乳头、腭中缝及腭皱。

以切牙乳头后方的腭皱凹沟为第一沟，将腭皱凹沟依次向远中命名为第二至第八沟，作为口内解剖标志。双侧上颌磨牙牙槽嵴位于第三、第四沟的中线至第八沟之间对应的牙槽粘膜下方颌骨内。其中，第一磨牙前界约为第三、第四沟的中线对应牙槽骨内，后界约为第六沟与第七沟之间；以第一磨牙后界为前界，第二磨牙的后界为第八沟。

2)切口

取11号手术刀片，在右侧腭粘膜上自远中至近中作一纵行切口，切口平行于腭中缝及牙槽嵴顶，深抵骨面，腭侧观约为腭中缝与牙槽嵴顶的中线，起自第七沟，终点为第三沟。

自纵行切口的终点作一横行切口，平行于腭皱凹沟，深抵骨面，向右颊侧延伸，越过牙槽嵴向头端的延长线，至颊侧前庭沟底，与纵行切口形成l形。

3)翻瓣

自l形切口交点处用显微镊尖端小心地自骨面挑起粘骨膜瓣，向远中及颊侧分离，达第一磨牙颊侧的前庭沟底。轻轻将粘骨膜瓣挑起，并使之最终贴附在颊粘膜上，暴露骨面。由于牙槽嵴顶处无骨质，翻瓣过程中应小心分离，保证粘骨膜瓣的完整。

4)骨切开

用显微镊尖端在牙槽嵴近中基底部轻轻夹破骨质，形成一个平行于腭平面的c形骨切口。将显微镊轻轻插入c形骨切口中部，向上挑起，可分离一u形骨片，为覆盖第一磨牙冠部的大部分骨质。此时可见第一磨牙的数个牙尖，继续向周围小心分离，去除可能影响牙胚脱位的骨质，直至第一磨牙颌面完全暴露。此时如继续向后剥离骨质亦可暴露至第二磨牙颌面。由于粘骨膜瓣在颊侧与牙槽嵴关系密切，术野较小，应将其轻轻推开，仔细查看第一磨牙牙冠颊侧的骨质是否去除足够，以免其对牙脱位产生阻力，及干扰移植时的就位。术中应对不影响牙胚拔除及移植就位的骨质予以保护，尽量保证剩余牙槽窝的完整性。

5)取出牙胚

使用显微镊探入第一磨牙的颊腭侧，轻轻夹住予以垂直偏远中方向的力使之完整脱位。为尽量保存牙槽窝各壁骨质，骨切开范围较小，常常难以夹持。此时，可向颊侧轻推牙冠的颌面颊侧，使之在牙槽窝内向颊侧旋转约90度，可很容易地从颌面和根方牙乳头两面夹住牙胚，予以脱位。切忌使用暴力引起牙槽窝的破坏或是夹碎牙胚。由于第一磨牙的牙尖偏向远中，近中牙槽骨下方存在倒凹，如牙胚碎裂或是牙乳头分离滞留牙槽窝内，近中倒凹下方因术野受限，且器械难以抵达，容易造成牙胚拔除不完全，故因小心谨慎，尽量将牙胚完整地从牙槽窝脱位。

术后显示植入牙胚未出现脱落情况，即移植成功率可达100％。

关于麻醉剂，前期预实验证明戊巴比妥较水合氯醛更安全。由于小鼠体重小，麻醉剂用量小，故将常规的1％戊巴比妥稀释为0.5％，使注射剂量更容易得以控制。但由于乳鼠的腹腔容积很小，不推荐更高的稀释倍数，超量液体进入导致的腹腔高压力会使注射液自针道返流溢出。

小鼠钟状末期上颌第一磨牙牙胚拔除及移植模型是观察移植牙牙根发育的一种有效模型，施术者熟练掌握后，其重复性强，成功率稳定。

目前临床上有大量因正畸需要拔除第三磨牙牙胚的案例，其牙胚大体也处于钟状末期，有矿化的牙冠而牙根尚未开始发育。如考虑将这些取出的牙胚进行自体移植来补充缺失牙，亦可使用本模型进行研究。

试验一移植后评估

取术后3周的小鼠实施安乐死。剥离上颌骨，4％多聚甲醛(ph＝7)固定过夜，pbs缓冲液洗涤浸泡。

microct扫描。扫描分辨率：8.87um，x射线源电压：50kv，x射线源电流：446ua，滤片：0.5mmal片，曝光时间：1200ms，扫描旋转步长：0.300度，360°扫描。重建方法：fdk锥状束重建，smoothing＝1，beamhardeningcorrection(％)＝35，ringartifactcorrection＝7，重建软件：nrecon，图像处理软件：dataviewer。

完成扫描后，将组织浸泡于10％edta溶液中进行脱矿，每2-3天更换一次脱矿液，脱矿时间与样品取材时的日龄一致，即8日龄样品脱矿8天，29日龄样品则脱矿29天。

梯度脱水，石蜡包埋，切片和h&e染色方法同上部分所述。

小鼠上颌第一磨牙的观察

体视显微镜观察出生后第八天及第十天的小鼠上颌第一磨牙牙胚，出生后第八天的牙胚冠部为硬组织，可见牙尖形成，根方敞开，牙根尚未形成，根面为牙乳头软组织；出生后第十天的小鼠上颌第一磨牙牙胚的根方见不规则隆起，已可分辨出隆起的形态与即将发育的三个牙根的形态相匹配。

h&e染色示，出生后第八天的牙胚仅具牙冠硬组织，牙根尚未形成，根方界线平直；出生后第十天的牙胚已见牙根的发育，根方可见牙根凸起。

出生后第八天的离体上颌第一磨牙h&e染色示，操作并未对赫特威尔氏上皮根鞘(hertwig'sepithelialrootsheath，hers)细胞层及根方牙乳头造成损失，其二者外部尚可见牙囊组织包被。

试验二术后牙胚状况的评估

术后1周，2周，3周分别取材行microct(micro-computedtomography,显微计算机断层扫描)观察，牙胚在位良好，未出现脱落情况(图片未显示)。植入后牙胚可在牙槽窝内继续发育，有类似于正常的牙根形成，术后2周可见牙冠萌出。组织学染色示，相较于肾被膜下移植，牙槽窝内移植的牙胚牙根发育程度较好：生理对照组术后3周大牙根基本发育成熟，原位移植组牙根大约可达正常牙根的长度，而肾被膜下移植组的牙根较为短(如图1)，原位移植组的牙根长于肾被膜下移植组的牙根。术后3周microct也提示了同样的结果(如图2)。小鼠钟状末期上颌第一磨牙牙胚拔除及移植模型是观察移植牙牙根发育的一种有效模型，施术者熟练掌握后，其重复性强，成功率稳定。

本试验尝试分离小鼠上颌第一磨牙牙胚，通过体视显微镜下及组织学观察，证明了实验操作并未对牙胚结构造成破坏且重复性好，进一步验证了该模型的可靠性。

将本模型与经典肾被膜下移植模型对比，发现牙胚在肾被膜下发育不完全，所形成的牙根十分短小畸形，从microct的图像上几乎无法测量其长度。故从牙根发育的角度上看，本试验更加适合作为移植模型。牙槽窝可能为牙根的发育提供了特殊的环境。早期的颌骨与牙胚相对独立，当牙胚发育至帽状期时，颌骨组织与牙胚开始发生接触，随后逐渐包绕牙胚，很大程度上影响了牙胚的发育。牙冠形成后的牙胚位于颌骨的形成与改建并存的环境中，而颌骨的改建状态又将继续调控着牙根的发育。

在牙胚拔除模型的建立中，腭粘骨膜瓣的完整性尤为重要，而良好的视野又是保证翻瓣质量的前提。由于小鼠口内空间封闭且狭小，目前较流行的体视显微镜环形光源无法给予清晰的术野，本试验采用的是光导纤维式光源。以施术者惯用右手为例，双光导纤维管分别由施术者的左侧及正面投照术区，术者的左手持显微镊可自双光导纤维管之间进入术区做开口及固定，右手则在正面光导纤维管的右侧有一定的操作空间，完成牙拔除和移植。此种小鼠体位及设备工具安放的设计即可保证清晰的光源入路，又令施术者有足够的空间进行操作。另外，由于基本配置的体视显微镜只设置一对目镜，助手无法清晰地观察术区对施术者进行有效辅助。而本模型可完全由术者一人独立完成，不需要对设备特殊要求，所需人力和硬件成本较低。

以本模型为基础亦可建立上颌第二磨牙牙胚的拔除及移植模型。

试验三

本部分试验利用前面中内容已建立的小鼠模型，对牙胚实施体外冻存后行体内原位移植，初探其成活率，是否能发育成牙根，以及有无口内萌出。

出生后第八天小鼠上颌第一磨牙的冻存

小心分离小鼠右侧上颌第一磨牙，每一牙胚单独浸泡于1ml新鲜配制的含10％dmso的bgjb培养基中，静置10分钟后使用程序降温冻存盒置于-80℃冰箱中过夜，次日将冻存管转移至液氮中保存。按照冻存时间分为三组，分别为保存1周、4周和12周。

冻存牙胚的复苏与移植

牙胚保存1周、4周或12周后，置于37℃水浴中快速解冻复苏。pbs缓冲液洗涤2次后浸泡待用。

取复苏后的牙胚移植至出生后第八天的小鼠上颌第一磨牙新鲜拔牙窝内，麻醉药物的使用为氯化美托咪定(0.3mg/kg)，咪达唑仑(4mg/kg)，酒石酸布托啡诺(5mg/kg)。鼠颌骨作为对照，分别于术后1周，2周和3周使用过量异氟烷吸入的方法处死取材，每组每时间点取8个重复样品。实验分组如下表1：

表1

其中，冻存组及新鲜牙胚组取自右侧上颌，生理牙胚组均取自左侧上颌。

对上述时间点的小鼠行安乐死，剥离上颌骨，使用新鲜配制的4％多聚甲醛(ph＝7)在4℃冰箱中固定过夜，0.1mpbs(phosphatebufferedsolution,磷酸盐缓冲液)洗涤浸泡，短期保存在4℃冰箱待用。

microct扫描。参数为80kv,120μa,8μm/pixel。使用tri3dbon64软件(ratoc,日本)对原始数据进行重建，imagej(nationalinstitutesofhealth,bethesda,美国)软件测量牙根长度。牙根长度的测量方法为：以釉牙本质界为基准做一平面，以牙根距离该平面最远点的点面距离作为牙根长度，如图3所示。牙根未发育则记为0μm。

完成扫描后，体视显微镜下观察其萌出情况并采图，再将组织浸泡于10％edta溶液中进行脱矿。

梯度脱水及透明。50％乙醇，60％乙醇，70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇，95％乙醇，100％乙醇(i)，依次分别浸泡30分钟，100％乙醇(ii)中4℃过夜。柠檬烯(i)与柠檬烯(ii)各浸30分钟，将组织置于63℃液体石蜡中，每45-60分钟更换一次石蜡，更换四次后置于金属台面包埋。静置过夜，4℃冰箱中冷藏15分后脱模。

将样品沿矢状面切片，制备成5μm厚的组织切片，行苏木素-伊红染色(h&e染色)。

h&e染色：1)组织脱蜡：柠檬烯(i)，柠檬烯(ii)，各1分钟；

2)组织复水：无水乙醇(i)，无水乙醇(ii)，90％乙醇，70％乙醇，50％乙醇，各1分钟；自来水浸泡两次，每次1分钟，双蒸水浸泡1分钟。

3)染色：苏木素染色3分钟，自来水洗3次，双蒸水浸泡2次，每次1分钟；伊红染色2分钟，自来水洗3次，双蒸水浸泡2次，每次1分钟。

4)组织脱水：50％乙醇，60％乙醇，70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇，95％乙醇，无水乙醇(i)，无水乙醇(ii)，各1分钟。

5)透明及封片：无水乙醇柠檬烯(1:1)混合液(i)，无水乙醇柠檬烯(1:1)混合液(ii)，柠檬烯(i)，柠檬烯(ii)，柠檬烯(iii)各1分钟，滴加适量中性树胶后盖玻片封片，室温通风过夜后显微镜下观察。

统计学分析

对microct图像中的牙根长度数据进行统计，使用spss22.0软件(ibmcorp.,armonk,ny,美国)，行kruskal–wallis检验和mann-whitneyu检验，使用bonferroni校正p值后，小于0.005被认为有统计学差异。

结果分析：对冻存牙胚移植后萌出情况的观察

术后3周大体观，移植牙牙冠较生理牙偏黄(图4)。未见牙齿脱落，大部分样品能够萌出，触之稳固无松动，颌面窝沟中可查见食物或垫料残渣。仅有个别样品完全未萌出。将“大部分萌出”及“完全萌出”定义为“萌出完成”(萌出的定义标准见图4)。统计结果如下表2：

表2

结果可见，术后1周各组均没有牙齿萌出；术后2周各组均开始发生萌出；术后3周，冻存各组及新鲜组均有可见半数或半数以上的萌出完成。

本发明将钟状末期的牙胚在体外分别进行了1周、4周和12周的冻存，再将复苏后的牙胚移植至出生后第八天的小鼠拔牙窝内，并在术后1周、2周和3周分别取材，从影像学和组织学上与新鲜牙胚的即刻移植牙以及正常牙齿作对比。

结果显示，移植的牙齿不论是否历经了冻存，术后均可成活并萌出。1-12周的冻存似乎并未对牙根的生长造成不良影响，冻存牙胚与新鲜牙胚在移植术后的发育状态未见明显差异。

试验四冻存牙胚移植后micoct的观察和牙根长度的统计分析

用micoct的观察冻存1周、4周以及12周牙胚移植，以及生理牙胚组和新鲜牙胚移植组。

microct图像显示，移植各组的牙根均有发育。术后1周，牙根在ct图像上几乎不可见，术后2周时可见各组牙根发育(图片未显示)。术后3周即29日龄，生理组牙根发育几乎完成，长度达到最大值(图5，a)。相较于根面光滑平直的生理组，移植各组的牙根形态相对复杂，可见或多或少的弯曲，根面有凹凸感(图7，b-e)。牙根与牙槽骨间的牙周部位可查见低密度区，偶有个别样品的出现了局部小范围的间隙狭窄或是消失情况(图6)。小鼠上颌第一磨牙具有3个牙根，即近中根、远中颊根和远中腭根。其中，近中根较为粗大，向近中倾斜角度较大(图5，a右)，远中颊根较为短小直立(图5，a左)，远中腭根位于远中颊根的近中腭侧，与远中颊根距离较近，且形态与长度与远中颊根相似(图片未显示)。在移植各组中，可见部分样品出现1-2个牙根缺失的情况，缺失与分组关系不明显，不论是否历经冻存均可发生(图片未显示)。

移植各组牙冠颌面的釉质高密度影像消失。矢状面观，仅在牙冠近远中可见少量较薄的高密度影像。几乎大部分样品的髓腔中可见点状钙化影像，部分样品牙冠可见局部牙本质表面缺损。对各组牙根长度数据两两比较，经mann-whitneyu检验，使用bonferroni校正p值后，生理组与冻存1周组、生理组与冻存12周组有统计学差异；冻存组与新鲜组牙根长度无统计学差异。

另外，移植各组的牙髓和牙周组织绝大部分可存活，牙髓中可见血管形成，极少数样品出现了龋坏穿髓和牙髓坏死(图片未显示)。移植各组在术后1周后均可见牙根已开始发育(图7，d,g,j,m)，且随时间推移能够继续伸长，但形态上较生理牙齿不规则，根部可见弯曲，分歧及分叉，髓室底及根管壁的矿化硬组织可查见增厚。牙根表面不如生理牙根平滑，但在牙根与牙槽骨间可见牙周软组织，偶有个别样品的局部出现了牙根与牙槽骨的骨性结合(图6)。从组织学总体结构上看，冻存各组与新鲜组并未见明显差异。

历经了最长12周的冻存后，原位植入的牙胚在术后3周大部分可萌出，并行可使咀嚼功能。少部分牙胚尚未完全萌出，颌面尚有龈瓣覆盖，极个别样品完全未萌出，可能存在牙根发育异常。整体来看，1-12周的体外冻存并未对移植牙胚的发育产生严重的影响。移植后的牙胚能够存活，牙根能够继续发育。

从试验一和试验二中可得，牙胚经1-12周冻存后可存活，原位移植后能够发育成牙齿并与颌骨建立稳固的牙周关系。冻存牙胚发育形成的牙根长度与新鲜牙胚无明显差异。冻存牙胚与新鲜牙胚移植后的继续发育状态未见明显差异。体外冻存手段未对牙胚造成不良影响。

本发明中自体牙胚体外冻存培养，扩大自体牙移植的适应证范围外，由于牙胚自身尚具备发育潜能，未来还可能发育成为完整的牙根。同时牙乳头的分化潜能较强，可在移植术后发育成为具有生理功能的牙髓组织。也解决了临床上已在使用的即刻自体牙移植技术，术后牙髓活力常常不能得到保留，需要后期行根管治疗等存在的问题。

本发明中建立了一种重复性好，稳定可靠的动物模型，即小鼠钟状末期上颌第一磨牙牙胚的拔除与移植模型，在此模型基础上，对分别冻存了1周，4周和12周的牙胚进行原位移植，术后1周、2周和3周分别取材，通过对牙齿萌出过程的观察，移植牙胚的影像学和组织学追踪，试验结果显示，采用本发明中方法不既牙胚体外冻存能够实现的，且具有好的效果。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。