专利名称：一种简化的细胞冻存降温方法
技术领域：
本发明涉及组织细胞培养技术，广泛适用于细胞生物学技术领域。
长期以来，国内外常用的组织培养冻存细胞技术中的降温过程，是将具有生物活性的细胞溶液，从37℃的生长状态，采用逐级降温法的过程冻存，即活性细胞悬液→-20℃，2-4小时→-40℃，2-4小时→-80℃，8-16小时→浸入液态氮(-196℃)，此过程最短需要8小时，最长需要4-24小时，同时需要3种不同温度的低温设备。采用常规逐级降温法冻存的细胞，在排除其他影响的条件下，是安全、可靠的，不影响细胞的复苏率，细胞复苏率是指在长期冷冻保存状态下的细胞，经过复苏过程，恢复其活性与生物学特性的细胞数量。所以细胞冻存、复苏的任一过程都与复苏率相关。
发明的技术内容本发明目的是提供一种简化的细胞冻存降温方法，该方法可以在保持较高细胞复苏率的前提下，减少冻存操作时间，并且同时减少了低温设备。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术措施是将活性细胞混入细胞冻存液中，分装于无菌塑料小管内，直接浸入液态氮中，长期保存。
本发明与现有技术相比，其优点是缩短了细胞冻存的操作过程，节约时间8-24小时；省去了三种不同温度的低温设备，降低工作成本，提高工作效率，不影响冻存细胞的复苏率。
细胞复苏率1、从液态氮中取出冻存的地鼠肾细胞(BHK-21)、人鼻咽癌组织细胞(Hep-2)、猪肾细胞(PK)、人肝癌细胞(7721)各一小管→37℃水浴中，3分钟速溶→加入8毫升细胞培养液，离心4000转/10分钟→弃上清→加入10％小牛血清MEM培养液10毫升/瓶→静置37℃，培养16小时-24小时；
2、光镜下观察复苏后的细胞状态，可见地鼠肾细胞(BHK-21)、人鼻咽癌组织细胞(Hep-2)、猪肾细胞(PK)、人肝癌细胞(7721)均见细胞大面积贴壁生长，细胞形态好，大小均匀，折光性好；3、复苏率显示BHK-21细胞复苏率约65％，Hep-2细胞复苏率约70％，PK细胞复苏率约63％，7721细胞复苏率约73％；4、培养48小时后，细胞生长成单层，继续传代培养；5、完成了细胞复苏生长繁殖周期。
比较例细胞冻存过程取培养生长成单层的地鼠肾细胞(BHK-21)、人鼻咽癌组织细胞(Hep-2)、猪肾细胞(PK)、人肝癌细胞(7721)各一瓶→0.25％胰蛋白酶液，消化3分钟→弃胰酶液→加入MEM培养液10毫升，吹打混匀细胞悬液→离心4000转/10分钟→弃上清→加入细胞冻存液2毫升/管，置入洁净塑料小管→-20℃，2小时→-40℃，4小时→-80℃，8小时→浸入液态氮中保存两年。
细胞复苏率1、从液态氮中取出冻存的地鼠肾细胞(BHK-21)、人鼻咽癌组织细胞(Hep-2)、猪肾细胞(PK)、人肝癌细胞(7721)各一小管→37℃水浴中，3分钟速溶→加入8毫升细胞培养液，离心4000转/10分钟→弃上清→加入10％小牛血清MEM培养液10毫升/瓶→静置37℃，培养16小时-24小时；2、光镜下观察复苏后的细胞状态，可见地鼠肾细胞(BHK-21)、人鼻咽癌组织细胞(Hep-2)、猪肾细胞(PK)、人肝癌细胞(7721)均见细胞大面积贴壁生长，细胞形态好，大小均匀，折光性好；3、复苏率显示BHK-21细胞复苏率约64％，Hep-2细胞复苏率约72％，PK细胞复苏率约63％，7721细胞复苏率约70％；4、培养48小时后，细胞生长成单层继续传代培养；5、完成了细胞复苏生长繁殖周期。
权利要求
1.一种简化的细胞冻存降温方法，其特征在于将活性细胞混入细胞冻存液中，分装于无菌塑料小管内，直接浸入液态氮中，长期保存。
全文摘要
一种简化的细胞冻存降温方法，其特征在于将活性细胞混入细胞冻存液中，分装于无菌塑料小管内，直接浸入液态氮中，长期保存。本发明与现有技术相比，其优点是缩短了细胞冻存的操作过程，节约时间8－24小时；省去了三种不同温度的低温设备，降低工作成本，提高工作效率，不影响冻存细胞的复苏率。
文档编号C12N5/00GK1415745SQ0214470
公开日2003年5月7日 申请日期2002年12月6日 优先权日2002年12月6日
发明者李天宪, 范兆军, 陈绳亮, 熊克娟, 张忠 申请人:中国科学院武汉病毒研究所