蜂房芽孢杆菌在防治马铃薯疮痂病中的应用的制作方法

本发明属于微生物种质资源的开发与利用领域，尤其涉及蜂房芽孢杆菌在防治马铃薯疮痂病中的应用。
背景技术：
：马铃薯是世界第三大粮食作物。然而，作为马铃薯四大病害(疮痂病、晚疫病、粉痂病和病毒病)之一的马铃薯疮痂病却一直困扰着中国马铃薯生产，尤其对温室环境中培育马铃薯脱毒种薯造成严重威胁，产量损失20％左右，由于疮痂病菌产生毒素，对马铃薯品质的影响更为严重。在大规模生产脱毒微型薯过程中，疮痂病发生率达60％以上。近年来，该病在南方地区发生猖獗。2018年浙江省金华地区大田春马铃薯收获季，马铃薯块茎疮痂病受害严重(图1)，部分田块的发病率已达到90％以上。最近，在云南省一些地方的马铃薯疮痂病发生率已达100％，严重影响了马铃薯产量和品质，成为制约中国马铃薯生产的主要瓶颈之一。对罹病马铃薯块茎的致病菌进行分离鉴定结果表明，是由致病的疮痂链霉菌(streptomycesspp.)引起，毒素是疮痂病菌致病的主要因子。经浙江大学马铃薯疮痂病研究课题组鉴定，浙江省的优势马铃薯疮痂病种为streptomycesscabies和streptomycesacidiscabie，它们均产生疮痂病毒素。利用生物防治手段防治作物病害能有效地避免上述缺点，因而具有广阔的发展前途。其中拮抗细菌作为一类重要的生物防治制剂，在植物病害的综合防治中占有重要的一席之地。细菌在生物防治应用中的主要优势在于：(1)细菌的种类和数量众多，在植物根际和地上部大量存在；(2)细菌对病原菌的作用方式较广，可以通过竞争、拮抗和寄生、诱导植物产生抗性等方式对病原菌产生影响；(3)具有惊人的繁殖速度；(4)许多细菌存在于植物根际和地上部，对植物的生态比较适宜；(5)细菌大多可以人工培养，便于控制，在实践中易于操作；(6)有些细菌不仅能防治病害而且具有促生作用，可以增加作物产量。引起马铃薯疮痂病的疮痂链霉菌是一种顽固的土壤习居菌，可通过土壤传播病害，一旦发病难以控制，严重影响马铃薯块茎的产量和品质。众所周知，种植抗病品种是防治病害最有效的方法，但迄今为止，国内外尚无抗马铃薯疮痂病的品种，这可能与病菌的致病特性有密切关系。病害的农业防治手段因受地域及诸多条件的限制，也无法有效开展。目前防治马铃薯疮痂病的主要手段是使用化学杀菌剂，在化学防治上，农用链霉素和铜制剂已成为防治细菌病害的“万能药剂”，然而由于长期大量使用农药造成病菌的抗药性增强，这两种防治细菌病害的“万能药剂”对防治马铃薯疮痂病已基本无效。自然生态环境污染及农药残留的问题越来越突出，寻求农作物病害防治的新途径一直是人们努力的目标。技术实现要素：为了解决上述技术问题，发明人意外地发现蜂房芽孢杆菌可以有效抑制链霉菌的生长，从而防治马铃薯疮痂病，从而完成本发明。本发明的一方面提供蜂房芽孢杆菌在制备用于防治马铃薯疮痂病的菌剂中的应用。在本发明的一个具体实施方案中，所述蜂房芽孢杆菌为保藏号为cctccm2012448的蜂房芽孢杆菌菌株zjub2011-1。在本发明的实施方案中，所述菌剂为粉未制剂、液体制剂或固体制剂。在本发明的具体实施方案中，所述菌剂可通过喷施或灌根的方法施用。在本发明的另一些具体实施方案中，所述菌剂中蜂房类芽孢杆菌的浓度为107～108cfu/ml。在本发明的实施方案中，所述马铃薯疮痂病是由链霉菌(streptomyces.spp)引起的。在本发明的一些具体实施方案中，所述链霉菌选自s.scabies和s.acidiscabie中的至少一种，即所述马铃薯疮痂病是由s.scabies和s.acidiscabie单独或共同引起。在本发明的一个具体实施方案中，所述链霉菌为s.scabies和s.acidiscabie。即所述马铃薯疮痂病是由s.scabies和s.acidiscabie共同引起。本发明的有益效果与现有技术相比，本发明的有益效果为：蜂房类芽孢杆菌zjub2011-1可高效抑制疮痂链霉菌(streptomycesspp.)的生长，可用于防治由该病菌侵染引起的马铃薯疮痂病等植物病害，应用前景广阔。附图说明图1示出了马铃薯块茎疮痂病受害状况。图2示出了活体防病效果(依次为空白对照，蜂房芽孢杆菌zjub2011-1处理；阴性对照和阳性对照多菌灵处理)。具体实施方式为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。实施例以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。实施例1马铃薯疮痂病病原真菌分离纯化与鉴定从浙江省金华市农业科学院实验基地采集自然发病的马铃薯疮痂病薯块。依据koch法则，将获得的马铃薯疮痂病致病菌接种到健康马铃薯薯块上，发生马铃薯疮痂病后再分离，从马铃薯疮痂病薯块上分离纯化得到多株病原菌，经与马铃薯疮痂病标准对照菌株的比较及分子生物学鉴定，病菌被鉴定为2种致病菌streptomycesscabies和streptomycesacidiscabie，最终选用2株有代表性的致病菌s.scabies2016001和s.acidiscabie2016016作为试验接种用菌。实施例2拮抗细菌以上述2株代表性致病菌s.scabies2016001和s.acidiscabie2016016为指示菌，采用平板对峙法，在本实验室先前获得的纯培养细菌单菌落中筛选对马铃薯疮痂病菌具有抑制作用的菌株。将马铃薯疮痂病菌菌丝块(直径约7mm)置于pda平板中央，点接在平板边缘距中心25mm处，每个培养皿接4点，28℃培养3d，获得一株对2种马铃薯疮痂病菌有抑制效果菌株。该菌株为paenibacillusalveizjub2011-1，于2012年11月6日保存到中国典型微生物培养中心(cctcc)，保藏号为cctccno:m2012448，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。实施例3生防菌离体抑菌活性测定用打孔直径为7mm的打孔器打取生长旺盛的尖孢镰刀菌菌饼，转接于pda平板中央，在与其相距2cm的四个角上分别点接筛选所得的蜂房芽孢杆菌zjub2011-1，将培养皿置于28℃恒温箱中培养6d，以枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)生防菌1为阳性对照菌，未接拮抗菌为阴性对照，每个处理重复3次。采用dps软件对各组结果进行统计分析。分析结果显示，蜂房芽孢杆菌zjub2011-1对马铃薯疮痂病菌具有较显著的抑制能力，抑制率达到71.00％，高于阳性对照菌。实验结果如下表1所示。表1蜂房芽孢杆菌zjub2011-1离体抑制马铃薯疮痂病菌效果处理菌落直径(mm)抑制率(％)蜂房芽孢杆菌zjub2011-126.3±0.85c71.00芽孢杆菌181.6±0.87a0未接拮抗菌83.2±0.78a0注：1.表中数字右上角字母表示邓肯氏多重差异分析结果，同列不同相同字母表示差异显著(p<0.05)；2.抑制率(％)＝100×(阴性对照菌落直径－处理菌落直径)/(阴性对照菌落直径－7mm)实施例4生防菌活体防病效果测定处理组将蜂房芽孢杆菌zjub2011-1-1制成浓度为1×108cfu/ml的菌悬液，选取无病虫危害、无伤口、成熟度和大小基本一致马铃薯块茎浸入菌悬液中，浸泡时间为30min，间隔时间12h后在马铃薯块茎上接种马铃薯疮痂病菌s.scabies2016001和s.acidiscabie2016016菌的混合菌(1:1)，模拟自然发病中的病菌组成。同时设置三个对照组：常规农药50％多菌灵可湿性粉剂(江苏蓝丰生物化工股份有限公司)的300倍稀释液浸种后接种马铃薯疮痂病菌为阳性对照；以无菌水浸种后接种马铃薯疮痂病菌为阴性对照；以接种无菌水不接马铃薯疮痂病菌为空白对照。置28℃的培养箱内培养，10d后调查发病情况。每个处理设置3个重复，取平均值。结果如图2、表2所示。表2各处理液对马铃薯疮痂病的活体防治效果处理病情指数防治效果(％)蜂房芽孢杆菌zjub2011-138.00a61.1250％多菌灵(阳性对照)93.33b0阴性对照93.33b0空白对照00马铃薯疮痂病的病情分级标准为：(1)0级:：无症状；(2)1级：病斑面积占整个块茎的0.1～1/5；(3)2级：病斑面积占整个块茎的1/5～2/5；(4)3级：病斑面积占整个块茎的2/5～3/5；(5)4级：病斑面积占整个块茎的3/5～4/5；(6)5级：病斑面积占整个块茎的4/5以上。病情指数＝(∑各级病块茎数×病情级别值)/(调查总数×最高级别值)×100；防治效果(％)＝(阴性对照病情指数－处理病情指数)/阴性对照病情指数×100％。综上所述，蜂房芽孢杆菌(paenibacillusalvei)zjub2011-1对引起马铃薯疮痂病的疮痂链霉菌(streptomycesspp.)具有较强的抑制作用，且在活体防病试验中，其菌悬液对马铃薯疮痂病有良好的防治效果，具有很好的生产应用前景。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12