本发明涉及农业
技术领域：
，具体而言，涉及山葡萄茎段的超低温保存方法、解冻方法以及解冻的山葡萄茎段。
背景技术：
：山葡萄(vitisamurensisrupr.)，是葡萄科(vitaleae)葡萄属(vitis)多年生落叶藤本浆果类果树，起源于我国东北、俄罗斯远东地区，朝鲜半岛亦有分布。山葡萄品种基本不发生白腐病、黑痘病和穗轴褐枯病，霜霉病发生较轻或不发生，不需喷布农药防治病害，用其浆果酿造“绿色山葡萄酒”己成为现实，由于山葡萄浆果含糖量(可溶性固形物)可达18％-23％，由酿造低档甜红山葡萄酒上升到酿造高档干红山葡萄酒已成为现实。随着山葡萄酿酒业的不断发展，人类对原料的需求量越来越大，过度开发、利用自然资源的活动加剧，破坏了野生山葡萄的生存环境，山葡萄种群数量锐减，处于灭绝或濒临灭绝的边缘。因而，种质资源的保存可以确保山葡萄种质资源不再流失，对山葡萄种质创新以及优质种苗的生产至关重要。现有技术通常采用田间圃位保存或者试管苗保存，田间圃位保存易受自然灾害影响而导致种质丢失或毁灭，而试管苗保存易因多次继代引起遗传性状变异或污染。因此，用于繁育的山葡萄茎段的保存或长期保存尤为重要。目前，超低温保存是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，因而可以保持种质的遗传稳定性，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期保存方式。但现有的山葡萄茎段基本不采用超低温保存，或即使采用了超低温保存其存活率均较低，大都难以超过50％。鉴于此，特提出本申请。技术实现要素：本发明提供了一种山葡萄茎段的超低温保存方法，旨在延长山葡萄茎段的保存时间，并且在可长时间保存的情况下解冻后具有较高的萌发率。本发明提供了一种超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法，该方法用于解冻经本发明提供的山葡萄茎段的超低温保存方法保存后的山葡萄茎段，解冻后的山葡萄茎段的萌发率高。本发明还提供了一种经超低温保存后解冻的山葡萄茎段，该山葡萄茎段的萌发率高。本发明是这样实现的：一种山葡萄茎段的超低温保存方法，包括：将带有休眠芽含水率为28％～32％的山葡萄茎段置于真空容器内；将放置有山葡萄茎段的真空容器在降温速率0.2～0.6℃/min的条件下降温至-200～-160℃后投入液氮环境中保存。一种超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法，包括：将经上述的保存方法保存的山葡萄茎段从液氮环境中取出置于室温下自然解冻1.5～2.5h，然后置于水中浸泡22～26h。一种经超低温保存后解冻的山葡萄茎段，采用上述的解冻方法解冻得到。本发明的有益效果是：本发明通过上述设计得到的山葡萄茎段的超低温保存方法，由于采用液氮超低温保存，使得保存过程中山葡萄茎段细胞的新陈代谢几乎完全停止，该方法能够实现山葡萄茎段的长期保存，而保存前使得山葡萄茎段含水量降至28％～32％范围内，将此含水率的山葡萄茎段真空封装，并以0.2～0.6℃/min的降温速率，降温至-200～-160℃后立即投入液氮环境中，能够使得超低温冷冻保存后，解冻得到的山葡萄茎段的萌发率达到65％及以上。本发明通过上述设计得到的超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法，用于解冻本发明提供的超低温保存方法冷冻保存后的山葡萄茎段，解冻后的山葡萄茎段萌发率高。本发明通过上述设计得到的经超低温保存后的山葡萄茎段，采用本发明提供的解冻方法解冻得到，该山葡萄茎段的萌发率高。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例提供一种山葡萄茎段的超低温保存方法、超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法以及经超低温保存后解冻的山葡萄茎段进行具体说明。一种山葡萄茎段的超低温保存方法，包括：s1、将带有休眠芽含水率为28％～32％的山葡萄茎段置于真空容器内。具体地，于冬季一月份取直径为0.6cm～0.8cm山葡萄枝截成长度为8cm～12cm的山葡萄茎段，每个茎段上休眠芽个数为一个。然后将山葡萄茎段置于冰箱中调节温度至2～5℃，使得山葡萄茎段干燥至温度为28％～32％。然后将山葡萄茎段置于铝箔袋中，并对铝箔袋抽真空封口。优选上述尺寸的山葡萄茎段更适合超低温保存，保存后的萌发率相对较高，同样的，优选每个茎段留一个休眠芽也是为了保证后续的萌发率能够更高。而优选将山葡萄茎段置于2～5℃环境下干燥则能保证不伤害茎段细胞结构的前提下降低细胞活性，使得细胞失水至合适范围内。s2、将放置有山葡萄茎段的真空容器在降温速率0.2～0.6℃/min的条件下降温至-200～-160℃后投入液氮环境中保存。具体地，将装有山葡萄茎段的铝箔袋真空袋置于程序降温仪中以降温速率0.2～0.6℃/min，降温至-200～-160℃后迅速投入液氮罐中保存，以免转移过程中温度发生改变。本发明提供的山葡萄茎段的超低温保存方法，由于采用液氮保存，使得保存过程中山葡萄茎段细胞的新陈代谢几乎完全停止，该方法能够实现山葡萄茎段的长期保存，山葡萄茎段由于含水量在28％～32％范围内，该含水量不至于过低而使得细胞容易因含水率低死亡，也不至于过高使得后续在超低温环境下因含水率过高由大量水状态变化造成细胞死亡。而山葡萄茎段置于真空容器中可与空气隔绝且置于液氮中后也不与液氮直接接触，使得山葡萄茎段置于液氮中时能够有效避免山葡萄茎段的细胞死亡。而将山葡萄茎段以本发明提出的降温速率降温至合适温度范围内，能够使得山葡萄茎段逐步适应低温环境，以提高存活率。降温速率不可过高也不可过低，过高过低都会使得山葡萄茎段的萌发率大大降低，降低的温度未达到本发明要求的范围就投入液氮环境中，温度过高山葡萄茎段还未适应低温也会造成萌发率大大降低。一种超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法，包括：将经上述的保存方法保存的山葡萄茎段从液氮环境中取出置于室温下自然解冻1.5～2.5h，然后置于水中浸泡22～26h。采用本发明超低温保存的山葡萄茎段采用本发明提供的解冻方法进行解冻后山葡萄茎段的萌发率高。为进一步提高萌发率置于水中浸泡22～26h是：前5～7h每50～60min换水一次，22～26h内的剩余时间每5～7h换水一次。优选地，浸泡用到的水为纯净水。一种经超低温保存后的山葡萄茎段，采用本发明提供的解冻方法解冻得到，该山葡萄茎段的萌发率高。以下结合具体实施例对本发明提供的一种山葡萄茎段的超低温保存方法、超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法以及经超低温保存后解冻的山葡萄茎段进行具体说明。实施例1本实施例提供了一种山葡萄茎段的超低温保存方法、超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法以及经超低温保存后解冻的山葡萄茎段。一种山葡萄茎段的超低温保存方法，包括：于冬季一月份取直径为0.6cm～0.8cm山葡萄枝截成长度为8cm的山葡萄茎段，每个茎段上休眠芽个数为一个。然后将山葡萄茎段置于冰箱中调节温度至4℃，使得山葡萄茎段干燥至温度为30％。然后将山葡萄茎段置于铝箔袋中，并对铝箔袋抽真空封口。将装有山葡萄茎段的铝箔袋真空袋置于程序降温仪中以降温速率0.5℃/min，降温至-180℃后迅速投入液氮罐中保存，以免转移过程中温度发生改变。一种超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法，包括：将经本实施例提供的山葡萄茎段的超低温保存方法保存后的山葡萄茎段从液氮罐中取出置于室温下自然解冻2h，然后置于水中浸泡，一共浸泡24h，前6小时每1小时换水一次，后18个小时每6小时换水一次，浸泡完后取出山葡萄茎段，解冻完成，解冻后的山葡萄茎段为本实施例提供的经超低温保存后解冻的山葡萄茎段。实施例2本实施例提供了一种山葡萄茎段的超低温保存方法、超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法以及经超低温保存后解冻的山葡萄茎段。一种山葡萄茎段的超低温保存方法，包括：于冬季一月份取直径为0.6cm～0.8cm山葡萄枝截成长度为12cm的山葡萄茎段，每个茎段上休眠芽个数为一个。然后将山葡萄茎段置于冰箱中调节温度至2℃，使得山葡萄茎段干燥至温度为28％。然后将山葡萄茎段置于铝箔袋中，并对铝箔袋抽真空封口。将装有山葡萄茎段的铝箔袋真空袋置于程序降温仪中以降温速率0.2℃/min，降温至-160℃后迅速投入液氮罐中保存，以免转移过程中温度发生改变。一种超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法，包括：将经本实施例提供的山葡萄茎段的超低温保存方法保存后的山葡萄茎段从液氮罐中取出置于室温下自然解冻1.5h，然后置于水中浸泡，一共浸泡22h，前7小时每1小时换水一次，后15个小时每5小时换水一次，浸泡完后取出山葡萄茎段，解冻完成，解冻后的山葡萄茎段为本实施例提供的经超低温保存后解冻的山葡萄茎段。实施例3本实施例提供了一种山葡萄茎段的超低温保存方法、超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法以及经超低温保存后解冻的山葡萄茎段。一种山葡萄茎段的超低温保存方法，包括：于冬季一月份取直径为0.6cm～0.8cm山葡萄枝截成长度为8cm的山葡萄茎段，每个茎段上休眠芽个数为一个。然后将山葡萄茎段置于冰箱中调节温度至5℃，使得山葡萄茎段干燥至温度为32％。然后将山葡萄茎段置于铝箔袋中，并对铝箔袋抽真空封口。将装有山葡萄茎段的铝箔袋真空袋置于程序降温仪中以降温速率0.6℃/min，降温至-200℃后迅速投入液氮罐中保存，以免转移过程中温度发生改变。一种超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法，包括：将经本实施例提供的山葡萄茎段的超低温保存方法保存后的山葡萄茎段从液氮罐中取出置于室温下自然解冻2.5h，然后置于水中浸泡，一共浸泡26h，前5小时每50min换水一次，后21个小时每7小时换水一次，浸泡完后取出山葡萄茎段，解冻完成，解冻后的山葡萄茎段为本实施例提供的经超低温保存后解冻的山葡萄茎段。实施例4本实施例提供了一种山葡萄茎段的超低温保存方法、超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法以及经超低温保存后解冻的山葡萄茎段。一种山葡萄茎段的超低温保存方法，包括：于冬季一月份取直径为0.6cm～0.8cm山葡萄枝截成长度为9cm的山葡萄茎段，每个茎段上休眠芽个数为一个。然后将山葡萄茎段置于冰箱中调节温度至3℃，使得山葡萄茎段干燥至温度为31％。然后将山葡萄茎段置于铝箔袋中，并对铝箔袋抽真空封口。将装有山葡萄茎段的铝箔袋真空袋置于程序降温仪中以降温速率0.3℃/min，降温至-190℃后迅速投入液氮罐中保存，以免转移过程中温度发生改变。一种超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法，包括：将经本实施例提供的山葡萄茎段的超低温保存方法保存后的山葡萄茎段从液氮罐中取出置于室温下自然解冻2.3h，然后置于水中浸泡，一共浸泡25h，前7小时换水时间段为60min、55min、50min、50min、55min、50min、50min、50min，后18个小时换水时间段为6、5、7，浸泡完后取出山葡萄茎段，解冻完成，解冻后的山葡萄茎段为本实施例提供的经超低温保存后解冻的山葡萄茎段。实施例5本实施例提供了一种山葡萄茎段的超低温保存方法、超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法以及经超低温保存后解冻的山葡萄茎段。一种山葡萄茎段的超低温保存方法，包括：于冬季一月份取直径为0.6cm～0.8cm山葡萄枝截成长度为11cm的山葡萄茎段，每个茎段上休眠芽个数为一个。然后将山葡萄茎段置于冰箱中调节温度至4℃，使得山葡萄茎段干燥至温度为29％。然后将山葡萄茎段置于铝箔袋中，并对铝箔袋抽真空封口。将装有山葡萄茎段的铝箔袋真空袋置于程序降温仪中以降温速率0.4℃/min，降温至-170℃后迅速投入液氮罐中保存，以免转移过程中温度发生改变。一种超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法，包括：将经本实施例提供的山葡萄茎段的超低温保存方法保存后的山葡萄茎段从液氮罐中取出置于室温下自然解冻1.8h，然后置于水中浸泡，一共浸泡23h，前7小时换水时间段为50min、60min、55min、50min、50min、55min、50min、50min，后16个小时换水时间段为5、6、5，浸泡完后取出山葡萄茎段，解冻完成，解冻后的山葡萄茎段为本实施例提供的经超低温保存后解冻的山葡萄茎段。对比例1本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，冷冻前将山葡萄茎段干燥至含水率为20％。对比例2本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，冷冻前将山葡萄茎段干燥至含水率为40％。对比例3本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，冷冻前将山葡萄茎段干燥至含水率为50％。对比例4本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，将山葡萄茎段置于50ml的螺旋口试管中然后再置于液氮罐中冷冻保存，不与液氮直接接触，但是非真空环境。对比例5本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，将山葡萄茎段直接置于液氮罐中保存，与液氮接触。对比例6本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，将山葡萄茎段置于程序降温仪中降温至-180℃，降温速率为1℃/min。对比例7本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，将山葡萄茎段置于程序降温仪中降温至-80℃，降温速率为0.5℃/min。对比例8本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，将山葡萄茎段置于程序降温仪中降温至-180℃，降温速率为1℃/min。实验例1按实施例1-5以及对比例1-8提供的冷冻方法，冷冻保存7天后按实施例及对比例提供的解冻方法，每组取40个茎段，解冻后，进行萌发实验，30天后记录萌发率。重复实验3次，记录各组平均萌发率至表1和表2。(将实施例简写为s，将对比例简写为d)表1各实施例山葡萄茎段的萌发率组别s1s2s3s4s5萌发率％70.8365.836566.6768.33通过表1能够看出，本发明各实施例提供的超低温冷冻方法冷冻保存后经本发明提供的解冻方法解冻的山葡萄茎段的萌发率均在65％及以上。这对于低温或超低温冷场来说萌发率较高。表2实施例1及各对比例山葡萄茎段的萌发率通过表2，将s1、d1、d2和d3进行对比，能够说明进行冷冻保存前，山葡萄茎段的含水率不可过低，含水率低于本发明要求的范围内时，冷冻后再解冻得到的山葡萄茎段不萌发；进行冷冻保存前，山葡萄茎段的含水率不可过高，含水率高于本发明要求的范围内时，冷冻后再解冻得到的山葡萄茎段萌发率低或不萌发。将s1、d4与d5进行对比，能够说明将山葡萄茎段置于液氮内保存时将山葡萄茎段进行密封真空封装后再置于液氮中冷冻保存解冻后的萌发率更高。将s1与d6、d7以及d8进行对比，能够说明超低温冷冻前降温过程降温速率不宜过高，高于本发明要求的降温速率范围时，解冻后的山葡萄茎段的萌发率较低，超低温冷冻保存前降至温度高于本发明要求的范围时也会使得解冻后的山葡萄茎段的萌发率降低。实验例2按实施例1提供的冷冻方法，分别冷冻保存2个月、一年以及5年，每组取100个茎段，冷冻保存后按实施例1提供的解冻方法解冻，解冻后进行萌发实验，30天后记录萌发率至表3。表3实施例1及各对比例山葡萄茎段的萌发率冷冻时间2月1年5年萌发率％706763将表3中各组萌发率与表1中s1组萌发率进行对比，发现冷冻保存7天与冷冻保存2月萌发率基本相同，而冷冻1年乃至冷冻5年后的存活率虽有下降，但是降幅不大。因此能够说明，本发明提供的超低温冷冻方法适合山葡萄茎段的长期保存。综上所述，本发明提供的山葡萄茎段的超低温保存方法，由于采用液氮超低温保存，使得保存过程中山葡萄茎段细胞的新陈代谢几乎完全停止，该方法能够实现山葡萄茎段的长期保存，而保存前使得山葡萄茎段含水量降至28％～32％范围内，将此含水率的山葡萄茎段正空封装，并以0.2～0.6℃/min的降温速率，降温至-200～-160℃后立即投入液氮环境中，能够使得超低温冷冻保存后，解冻得到的山葡萄茎段的萌发率达到65％及以上。本发明提供的超低温保存的山葡萄茎段的解冻方法，用于解冻本发明提供的超低温保存方法冷冻保存后的山葡萄茎段，解冻后的山葡萄茎段萌发率高。本发明提供的经超低温保存后的山葡萄茎段，采用本发明提供的解冻方法解冻得到，该山葡萄茎段的萌发率高。以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12