一种经基因工程改造的大肠杆菌菌株及其应用的制作方法

文档序号：18937623发布日期：2019-10-23 00:46阅读：737来源：国知局

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种经基因工程改造的大肠杆菌菌株及其应用。

背景技术：

在生物防治病害出现之前的很长一段时间内，植物病害防治主要以化学防治为主。农药防治呈现的趋势是高效即高毒，所以寻找高效低毒甚至无毒的病害防治方法也十分迫切。生物防治病害是解决化学防治高效高毒的方法中最为安全的之一。

通过从不同环境中分离具有病原菌具有拮抗作用的微生物是目前生防菌的主要筛选方法。但是，原生环境的改变对微生物的生活状态也是一种挑战，新环境的定植问题、发挥生防作用的时机和是否会导致被保护植物发病以及对周边环境的生物安全问题等，都是生防菌在实际应用中需要考虑的因素。

真菌致病菌在植物致病菌中占据约80％，其中大部分真菌通过菌丝侵染植物进而为害植物，并且在高温高湿的条件下会在病斑处长出绒毛(菌丝)，菌丝是真菌造成侵染危害的主要媒介。在黑粉菌属真菌中，黑粉菌经过配合产生菌丝侵染宿主植物，通过抑制菌丝生长就可以显著抑制病害。

目前尚无一种安全有效的防控黑粉菌属真菌的生防方法。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的尚无一种安全有效的防控黑粉菌属真菌的生防方法的不足，提供一种经基因工程改造的大肠杆菌菌株及其应用。

本发明的第一个目的是提供茉莉酸甲酯在防治黑粉菌中的应用。

本发明的第二个目的是提供茉莉酸甲酯转移酶基因在构建防治黑粉菌的工程菌中的应用。

本发明的第三个目的是提供茉莉酸甲酯转移酶在构建防治黑粉菌的工程菌中的应用，同时提供一种茉莉酸甲酯的仪器检测方法。

本发明的第四个目的是提供一种防治黑粉菌的工程菌。

本发明的第五个目的是提供所述的工程菌的制备方法。

本发明的第六个目的是提供一种防治黑粉菌的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明构建出一种黑粉菌菌丝生长具有抑制作用的大肠杆菌菌株。黑粉菌必须通过二型态转变形成双核菌丝对植物进行危害，而本发明中的大肠杆菌工程菌株对黑粉菌菌丝生长具有强烈的抑制作用，所以在黑粉病防治中具有潜在的应用价值。

因此本发明要求保护以下内容：

茉莉酸甲酯在防治黑粉菌中的应用。

茉莉酸甲酯转移酶基因在构建防治黑粉菌的工程菌中的应用，所述茉莉酸甲酯转移酶基因核苷酸序列如seqidno:1所示。

茉莉酸甲酯转移酶在构建防治黑粉菌的工程菌中的应用，所述茉莉酸甲酯转移酶氨基酸序列如seqidno:2所示。

优选地，所述黑粉菌为甘蔗鞭黑粉菌和玉米瘤黑粉菌中的一种或两种。

一种防治黑粉菌的工程菌，受体菌过表达茉莉酸甲酯转移酶。

优选地，受体菌为大肠杆菌。

所述的工程菌的制备方法，包括以下步骤：

s1.获得核苷酸序列如seqidno:1所示的茉莉酸甲酯转移酶基因；

s2.将茉莉酸甲酯转移酶连接到表达载体，得到重组载体

s3.将重组载体转入受体菌，得到工程菌。

优选地，表达载体为prsfduet-1。

一种防治黑粉菌的方法，将所述工程菌接种到植物上。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明的工程菌的产生的代谢产物为茉莉酸甲酯，并不存在生物安全性问题。

2、本发明的茉莉酸甲基转移酶来自植物，通过大肠杆菌表达后也不会带来生物安全性问题。

3、本发明得到的工程菌为大肠杆菌，培养条件简单，成本低廉，实施方法简便。

4、本发明所需反应底物均来自植物，通过提高早期植物体内激素茉莉酸甲酯含量来提高植物防御能力，实验证明并不影响植物生长。

5、将本发明工程菌应用于玉米瘤黑粉病的防治，具有明显的防治效果，值得大力推广应用。

附图说明

图1为茉莉酸甲酯处理抑制黑粉菌菌丝结果图

图2为用于表达植物源jmt基因的载体示意图。

图3为大肠杆菌e-jmt菌株对甘蔗鞭黑粉菌形成菌丝的抑制效果图。

图4为大肠杆菌e-jmt菌株提取物对两种黑粉菌形成菌丝的抑制效果图；a为提取物对玉米瘤黑粉菌的抑制情况；b为提取物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制情况。

图5为大肠杆菌e-jmt菌株将ja转化为meja的hplc测鉴定图。

图6为大肠杆菌e-jmt菌株将ja转化为meja的gc/ms测鉴定图。

图7为200μm茉莉酸甲酯的防治效果图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

(1)yepsa培养基的配制：(试剂均购买自鼎国昌盛)蛋白胨20g/l，酵母浸粉10g/l，蔗糖20g/l，琼脂4g/l，加1000ml水混匀后121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。

(2)yepsa-c培养基的配制：(试剂均购买自鼎国昌盛)蛋白胨20g/l，酵母浸粉10g/l，蔗糖20g/l，碳粉10g/l，琼脂4g/l，加1000ml水混匀后121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。

(3)lb液体培养基的配制：称取胰蛋白胨(tryptone，oxoidltdlp0042，england)10g，酵母提取物(yeastextract，oxoidltdlp0021，england)5g，氯化钠(nacl，国药集团化学试剂有限公司，10019318)10g，加水1000ml搅拌均匀，充分加热溶解后分装，121℃灭菌20min后贮存备用。

(4)lb固体培养基的配制：为lb液体培养基配置方法后添加再加15g琼脂，充分加热溶解后分装，121℃灭菌20min后贮存备用。

实施例1茉莉酸甲酯对两种黑粉菌菌丝生长的抑制作用

一、实验方法

1、甘蔗鞭黑粉菌菌液、玉米瘤黑粉菌菌液准备

取-80℃保存的甘蔗鞭黑粉菌(wt17、wt18)、玉米瘤黑粉菌(u9、u10)菌种点于yepsa平板上，28℃培养2～3天后刮取菌落于28℃200rpm条件摇菌，待用。

2、在yeps中添加茉莉酸甲酯终浓度为200μm，设置不加茉莉酸甲酯的为对照组，点甘蔗鞭黑粉菌于平板上于28℃培养三天，观察实验结果。在yeps-c中添加茉莉酸甲酯终浓度为400μm，设置不加茉莉酸甲酯的为对照组，点玉米瘤黑粉菌于平板上于28℃培养三天，观察实验结果。

二、实验结果

结果如图1，茉莉酸甲酯处理下，与对照组比较看出菌丝明显受到抑制，茉莉酸甲酯可以抑制两种黑粉菌菌丝的生长。

实施例2表达植物源茉莉酸甲基转移酶基因的工程菌构建

一、实验方法

1、茉莉酸甲基转移酶(jmt)表达载体构建

茉莉酸甲基转移酶基因序列(其核苷酸序列seqidno：1所示)，由苏州金唯智生物科技有限公司代为合成，并且在左右两端各添加了酶切位点ecori、sali，其核苷酸序列如下(下划线部分位为酶切位点)：

gaattcatggaggtaatgcgagttcttcacatgaacaaaggaaacggggaaacaagttatgccaagaactccaccgctcagagcaacataatatctctaggcagaagagtaatggacgaggccttgaagaagttaatgatgagcaattcagagatttcgagcattggaatcgccgacttaggctgctcctccggtccgaacagtctcttgtccatctccaacatagttgacacgatccacaacttgtgtcctgacctcgaccgtccagtccctgagctcagagtctctctcaacgacctccctagcaatgacttcaactacatatgtgcttctttgccagagttttacgaccgggttaataataacaaggagggtttagggttcggtcgtggaggaggagaatcgtgttttgtgtcggccgtcccaggttcgttctacggacgtttgtttcctcgccggagccttcactttgtgcattcttcttctagtttacattggttgtctcaggttccatgtcgtgaggcggagaaggaagacaggacaataacagctgatttagaaaacatggggaaaatatacatatcaaagacaagtcctaagagtgcacataaagcttatgctcttcaattccaaactgatttcttggtttttttgaggtcacgatctgaggagttggtcccgggaggccgaatggttttatcgttccttggtagaagatcactggatcccacaaccgaagagagttgctatcaatgggaactcctagctcaagctcttatgtccatggccaaagagggtatcatcgaggaagagaagatcgatgctttcaacgctccttactatgctgcgagctccgaagagttgaaaatggtgatagagaaagaagggtcattttcgatcgataggcttgagataagtccgattgattgggaaggtgggagtatcagtgaggagagttatgaccttgcaataaggtccaaacccgaagccctagctagtggccgaagagtgtctaataccataagagctgtggtcgagccgatgctagaacctactttcggtgaaaatgtgatggacgagctttttgaaaggtatgcaaagatcgtgggagagtacttctatgtaagctcgccacgatacgctattgttattctttcgctcgttagaaccggttgagtcgac

茉莉酸甲基转移酶氨基酸序列(其氨基酸序列seqidno：2所示)序列如下：

经双酶切后片段连接到载体prsfduet-1载体的多克隆位点上，启动子为t7启动子，其受lac操纵子操纵，并将质粒命名为pjmt。

2、含有载体pjmt载体工程菌的构建

大肠杆菌dh5α感受态细胞为实验室自己制备，转化方法如下：

取-80℃保存的大肠杆菌感受态细胞于冰上，待感受态细胞融化后添加pjmt质粒于感受态细胞中，并混匀。冰上静置30分钟后于42℃水浴锅中水浴1分钟，转移到冰上静置2分钟。冰浴结束后，添加500微升lb液体培养基于感受态中，在37℃200rpm摇床复苏1小时，涂于含有100mg/ml的卡那霉素的lb平板上，待菌落长出，经菌落pcr验证，于-80℃保存验证正确的大肠杆菌，并命名该菌为e-pjmt。

二、实验结果

构建的重组质粒pjmt结构图如图2。经测序转化后的阳性重组菌e-pjmt，茉莉酸甲基转移酶(jmt)的插入质粒的位点和插入序列均正确，可以用于进一步实验。

实施例3对峙培养法测定茉莉酸甲酯及大肠杆菌e-pjmt活性

一、甘蔗鞭黑粉菌菌液、玉米瘤黑粉菌菌液准备

取-80℃保存的甘蔗鞭黑粉菌、玉米瘤黑粉菌菌种点于yepsa平板上，28℃培养2-3天后刮取菌落于28℃200rpm条件摇菌，待用。

二、e-pjmt工程菌菌液准备

取-80℃保存的e-pjmt工程菌划线于lb平板上，37℃培养1天后挑取单菌落于lb液体培养基37℃200rpm摇菌，待用。

三、e-pjmt工程菌异源表达

取过夜摇菌的e-pjmt工程菌于50ml含有卡那霉素的lb培养基中，37℃200rpm摇菌，待菌液od600＝1.0，添加终浓度为1mm的iptg(异丙基硫代半乳糖苷，isopropylβ-d-thiogalactoside)于菌液中28℃200rpm摇菌4小时，待用。

四、活性测定：

1、e-pjmt对峙实验

(1)实验方法

取e-pjmt、玉米瘤黑粉菌、甘蔗鞭黑粉菌菌液按照中间是致病真菌，周围成品字形点e-pjmt工程菌，菌液各5μl点于含有200μm茉莉酸、200μmsam(s-腺苷基甲硫氨酸，s-adenosylmethionine)、1mmiptg的yepsa、yeps-c培养基上，28℃培养约3天观察对真菌的抑制作用。

(2)实验结果

结果如图3所示。e-pjmt能显著抑制甘蔗鞭黑粉菌两个交配型担孢子混合、交配以后形成菌丝。

结果讨论：通过对峙实验发现茉莉酸甲酯、e-pjmt(图3)、e-pjmt诱导表达后收集的上清液(图4)均对玉米瘤黑粉菌、甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长有抑制作用。

2、e-pjmt活性检测

(1)实验方法

取异源表达的e-pjmt工程菌菌液，离心收集菌体将菌体重新悬浮于10mllb含有200μm茉莉酸培养基中，于28℃200rpm摇床中培养约1天，离心取上清液约1ml，通过0.22μ滤膜过滤上清液除菌，上清液添加到培养基中(10％，v/v)，28℃培养约3天观察实验结果。结果如图4所示，结果表明上清液中含有能抑制甘蔗鞭黑粉菌两个交配型担孢子混合、交配以后形成菌丝的活性成分。

用约1.5倍体积的乙酸乙酯萃取上清液，乙酸乙酯萃取液通过旋转蒸发至干，用1ml甲醇从容器洗下来，过0.22μm的有机尼龙膜装至棕色样品瓶，待检测。(茉莉酸甲酯标准品购买自sigma-aldrich,cas#:1211-29-6)