用于转移生物分子至受伤细胞的组合物和方法与流程

用于转移生物分子至受伤细胞的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本申请要求2018年10月2日提交的美国临时申请序列号62/740,144的优先权权益，所述临时申请的公开内容据此以引用的方式整体并入。
技术领域
3.本发明整体涉及农业、植物生物技术和分子生物学领域。更具体而言，本发明涉及用于突变、编辑或遗传修饰植物细胞的组合物和方法。


背景技术：

4.产生具有新型遗传性状组合的植物的能力对于改善作物产量和抵抗病虫害压力是有用的。除了使植物杂交或繁育之外，还可以通过转基因或通过各种诱变技术来引入新型性状组合。然而，很多植物物种和品种很难从外植体或植物材料转化、培养和/或再生。本领域中需要用于将遗传元件和分子工具转移至可再生植物细胞以产生所期望的性状的新型和改进方法。


技术实现要素：

5.在一个方面，本发明提供了一种用于将生物分子转移至细胞中的方法，所述方法包括：a)将包含至少一种受体细胞的受体植物细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物；以及b)使所述经混合的细胞培养物的所述受体细胞受伤，以产生至少一种产物细胞，在所述混合和/或受伤之后，所述生物分子转移至所述产物细胞中已经发生。在一些实施方案中，所述受体植物细胞培养物、培养基或经混合的细胞培养物还包含渗压剂。在另外的实施方案中，所述渗压剂包括聚乙二醇(peg)。在另外其他实施方案中，所述渗压剂包括糖或糖醇。在一些实施方案中，所述受体植物细胞培养物的一个或多个受体细胞包含基因型、遗传背景、转基因、天然等位基因、所关注的编辑或突变。在其他实施方案中，所述至少一种产物细胞或其子代细胞包含来自所述受体植物细胞的基因型、遗传背景、转基因、天然等位基因、所关注的编辑或突变。在一些实施方案中，所述受体植物细胞培养物是愈伤组织培养物或细胞悬浮培养物。在一些实施方案中，所述至少一种生物分子包括位点特异性核酸酶、向导rna、或者一种或多种包含编码位点特异性核酸酶的序列和/或编码向导rna的序列的重组dna分子。在另外的实施方案中，所述位点特异性核酸酶是锌指核酸酶(zfn)、大范围核酸酶、rna指导的核酸内切酶、tale核酸内切酶(talen)、重组酶或转座酶。在一些实施方案中，所述受体植物细胞培养物的细胞是双子叶植物细胞。在另外的实施方案中，所述双子叶植物细胞选自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、芸苔和棉花细胞。在其他实施方案中，所述受体植物细胞培养物的细胞是单子叶植物细胞。在另外的实施方案中，所述单子叶植物细胞选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦、大麦和高粱细胞。本发明还提供了通过本文所述的方法产生的产物细胞。在一些实施方案中，所述产物细胞是双子叶植物细胞。在另外的实施方案中，所述产物细胞选
自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、芸苔和棉花植物细胞。在其他实施方案中，所述产物细胞是单子叶植物细胞。在另外的实施方案中，所述产物细胞选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦和高粱植物细胞。还提供了从通过本文提供的方法产生的所述产物细胞或其子代细胞再生的植物。在一些实施方案中，所述再生的植物是双子叶植物。在另外的实施方案中，所述双子叶植物选自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、芸苔和棉花植物。在其他实施方案中，所述再生的植物是单子叶植物。在另外的实施方式中，所述单子叶植物选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦、大麦和高粱植物。本文还提供了所述再生的单子叶植物和双子叶植物的种子、子代植物或子代种子。本文还提供了通过本文所述的方法产生的受伤的经混合的细胞培养物。
6.在另一个方面，本发明提供了一种用于将生物分子转移至细胞中的方法，所述方法包括：a)将包含至少一种受体细胞的受体植物细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物；以及b)使所述经混合的细胞培养物的所述受体细胞受伤，以产生至少一种产物细胞，在所述混合和/或受伤之后，所述生物分子转移至所述产物细胞中已经发生，其中所述受体植物细胞培养物包含具有质体基因组编码的标记基因和/或核基因组编码的标记基因的细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：c)在步骤(b)期间和/或之后，根据所述核基因组编码的标记基因和/或质体基因组编码的标记基因的存在，筛选或选择所述经混合的细胞培养物的所述至少一种产物细胞、或者其至少一种子代细胞、或者从所述至少一种产物细胞或其子代细胞发育或再生的植物。在其他实施方案中，所述核基因组编码的标记基因或所述质体基因组编码的标记基因是可选择的标记基因。在另外的实施方案中，所述可选择的标记基因选自由以下组成的组：aada、rrns、rrnl、nptii、apha
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6、psba、bar、hppd、asa2和ahas。在一些实施方案中，所述核基因组编码的标记基因或所述质体基因组编码的标记基因是可筛选的标记基因。在另外的实施方案中，所述可筛选的标记基因是gfp或gus。在一些实施方案中，所述受体植物细胞培养物的所述细胞或其子代细胞对于所述质体编码的标记基因是同质性的。
7.在另一个方面，本发明提供了一种用于将生物分子转移至细胞中的方法，所述方法包括：a)将包含至少一种受体细胞的受体植物细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物；b)使所述经混合的细胞培养物的所述受体细胞受伤，以产生至少一种产物细胞，在所述混合和/或受伤之后，所述生物分子转移至所述产物细胞中已经发生；以及c)根据可选择的或可筛选的标记，筛选或选择所述至少一种产物细胞或其子代细胞、或者从所述至少一种产物细胞或其子代细胞发育或再生的植物。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：d)从所述经混合的细胞培养物和/或所述至少一种产物细胞或其至少一种子代细胞再生植物。
8.在又一个方面，本发明提供了一种用于将生物分子转移至细胞中的方法，所述方法包括：a)将包含至少一种受体细胞的受体植物细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物；b)使所述经混合的细胞培养物的所述受体细胞受伤，以产生至少一种产物细胞，在所述混合和/或受伤之后，所述生物分子转移至所述产物细胞中已经发生；以及c)在步骤a)或步骤b)之前、期间或之后，将渗压剂添加至所述受体植物细胞培养物、培养基或经混合的细胞培养物中。在一些实施方案中，所述渗压剂包括聚乙二醇(peg)。在其他实施方案中，所述渗压剂包括糖或糖醇。
9.在又一个方面，本发明提供了一种用于将生物分子转移至细胞中的方法，所述方法包括：a)将包含至少一种受体细胞的受体植物细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物；b)使所述经混合的细胞培养物的所述受体细胞受伤，以产生至少一种产物细胞，在所述混合和/或受伤之后，所述生物分子转移至所述产物细胞中已经发生；以及c)筛选或选择至少一种经编辑或突变的产物细胞或其子代细胞，或者从具有所述编辑或突变的所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞发育或再生的植物。在一些实施方案中，根据通过所述编辑或突变产生的以及存在于所述发育或再生的植物或其子代植物、植物部分或种子中的性状或表型来筛选或选择从所述至少一种经编辑或突变的产物细胞或其子代细胞发育或再生的所述植物。在其他实施方案中，根据分子测定法来筛选或选择所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞、或者从所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞发育或再生的所述植物。
10.在另一个方面，本发明提供了一种用于将生物分子转移至细胞中的方法，所述方法包括：a)将包含至少一种受体细胞的受体植物细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物；b)使所述经混合的细胞培养物的所述受体细胞受伤，以产生至少一种产物细胞，在所述混合和/或受伤之后，所述生物分子转移至所述产物细胞中已经发生；以及c)从所述经混合的细胞培养物和/或所述至少一种产物细胞或其至少一种子代细胞再生植物。
11.本发明提供了一种用于将生物分子转移至细胞中的方法，所述方法包括：a)使受体植物细胞培养物的受体细胞受伤；以及b)将所述受体细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物，以及产生至少一种产物细胞，在所述受伤和/或混合之后，所述生物分子转移至所述产物细胞中已经发生。在一些实施方案中，所述受体植物细胞培养物、培养基或经混合的细胞培养物还包含渗压剂。在另外的实施方案中，所述渗压剂包括聚乙二醇(peg)。在另外其他实施方案中，所述渗压剂包括糖或糖醇。在一些实施方案中，所述受体植物细胞培养物是愈伤组织培养物或细胞悬浮培养物。在其他实施方案中，所述受体植物细胞培养物的一个或多个受体细胞包含基因型、遗传背景、转基因、天然等位基因、所关注的编辑或突变。在另外的实施方案中，所述至少一种产物细胞或其子代细胞包含来自所述受体植物细胞的基因型、遗传背景、转基因、天然等位基因、所关注的编辑或突变。在一些实施方案中，所述至少一种生物分子包括位点特异性核酸酶、向导rna、或者一种或多种包含编码位点特异性核酸酶的序列和/或编码向导rna的序列的重组dna分子。在另外的实施方案中，所述位点特异性核酸酶是锌指核酸酶(zfn)、大范围核酸酶、rna指导的核酸内切酶、tale核酸内切酶(talen)、重组酶或转座酶。在一些实施方案中，所述受体植物细胞培养物的细胞是双子叶植物细胞。在其他实施方案中，第一和/或第二植物细胞培养物的细胞是单子叶植物细胞。本发明还提供了通过本文所述的方法产生的产物细胞。在一些实施方案中，所述产物细胞是双子叶植物细胞。在另外的实施方案中，所述产物细胞选自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、芸苔和棉花植物细胞。在其他实施方案中，所述产物细胞是单子叶植物细胞。在另外的实施方案中，所述产物细胞选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦和高粱植物细胞。还提供了从通过本文提供的方法产生的所述产物细胞或其子代细胞再生的植物。在一些实施方案中，所述再生的植物是双子叶植物。在另外的实施方案中，所述双子叶植物选自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、
芸苔和棉花植物。在其他实施方案中，所述再生的植物是单子叶植物。在另外的实施方式中，所述单子叶植物选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦、大麦和高粱植物。本文还提供了所述再生的单子叶植物和双子叶植物的种子、子代植物或子代种子。本文还提供了通过本文所述的方法产生的受伤的经混合的细胞培养物。
12.在另一个方面，本发明提供了一种用于将生物分子转移至细胞中的方法，所述方法包括：a)使受体植物细胞培养物的受体细胞受伤；以及b)将所述受体细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物，以及产生至少一种产物细胞，在所述受伤和/或混合之后，所述生物分子转移至所述产物细胞中已经发生，其中所述受体植物细胞培养物包含具有质体基因组编码的标记基因和/或核基因组编码的标记基因的细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：c)在步骤(b)期间和/或之后，根据所述核基因组编码的标记基因和/或所述质体基因组编码的标记基因的存在，筛选或选择所述经混合的细胞培养物的所述至少一种产物细胞、或者其至少一种子代细胞、或者从所述至少一种产物细胞或其子代细胞发育或再生的植物。
13.在又一个方面，本发明提供了一种用于将生物分子转移至细胞中的方法，所述方法包括：a)使受体植物细胞培养物的受体细胞受伤；b)将所述受体细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物，以及产生至少一种产物细胞，在所述受伤和/或混合之后，所述生物分子转移至所述产物细胞中已经发生；以及c)根据可选择的或可筛选的标记，筛选或选择所述至少一种产物细胞或其子代细胞、或者从所述至少一种产物细胞或其子代细胞发育或再生的植物。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：d)从所述经混合的细胞培养物和/或所述至少一种产物细胞或其至少一种子代细胞再生植物。
14.在另一个方面，本发明提供了一种用于将生物分子转移至细胞中的方法，所述方法包括：a)使受体植物细胞培养物的受体细胞受伤；b)将所述受体细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物，以及产生至少一种产物细胞，在所述受伤和/或混合之后，所述生物分子转移至所述产物细胞中已经发生；以及c)在步骤a)或步骤b)之前、期间或之后，将渗压剂添加至所述受体植物细胞培养物、培养基或经混合的细胞培养物中。在一些实施方案中，所述渗压剂包括聚乙二醇(peg)。在其他实施方案中，所述渗压剂包括糖或糖醇。
15.在又一个方面，本发明提供了一种用于将生物分子转移至细胞中的方法，所述方法包括：a)使受体植物细胞培养物的受体细胞受伤；b)将所述受体细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物，以及产生至少一种产物细胞，在所述受伤和/或混合之后，所述生物分子转移至所述产物细胞中已经发生；以及c)筛选或选择至少一种经编辑或突变的产物细胞或其子代细胞，或者从具有所述编辑或突变的所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞发育或再生的植物。在一些实施方案中，根据通过所述编辑或突变产生的以及存在于所述发育或再生的植物或其子代植物、植物部分或种子中的性状或表型来筛选或选择从所述至少一种经编辑或突变的产物细胞或其子代细胞发育或再生的所述植物。在其他实施方案中，根据分子测定法来筛选或选择所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞、或者从所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞发育或再生的所述植物。
16.本发明提供了一种用于编辑植物细胞的方法，所述方法包括：a)将包含受体细胞的受体植物细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物，其中所述生物分子包括位点特异性核酸酶或包含编码可操作地连接至第一启动子的位点特异性核酸酶的序列的重组dna分子；以及b)使所述经混合的细胞培养物的所述受体细胞受伤，以产生至少一种具有通过所述位点特异性核酸酶引入它的基因组中的编辑或突变的经编辑的产物细胞。在一些实施方案中，根据通过所述编辑或突变产生的以及存在于所述发育或再生的植物或其子代植物、植物部分或种子中的性状或表型来筛选或选择从所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞发育或再生的所述植物。在其他实施方案中，根据分子测定法来筛选或选择所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞、或者从所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞发育或再生的所述植物。在一些实施方案中，所述受体植物细胞培养物、培养基或经混合的细胞培养物还包含渗压剂。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：c)在步骤a)或步骤b)之前、期间或之后，将渗压剂添加至所述受体植物细胞培养物、培养基或经混合的细胞培养物中。在另外的实施方案中，所述渗压剂包括聚乙二醇(peg)。在另外其他实施方案中，所述渗压剂包括糖或糖醇。在其他实施方案中，所述受体植物细胞培养物是愈伤组织培养物或细胞悬浮培养物。在一些实施方案中，所述受体植物细胞培养物的细胞是双子叶植物细胞。在另外的实施方案中，所述双子叶植物细胞选自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、芸苔和棉花细胞。在其他实施方案中，所述受体植物细胞培养物的细胞是单子叶植物细胞。在另外的实施方案中，所述单子叶植物细胞选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦、大麦和高粱细胞。本发明还提供了通过本文所述的方法产生的产物细胞。在一些实施方案中，所述产物细胞是双子叶植物细胞。在另外的实施方案中，所述产物细胞选自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、芸苔和棉花植物细胞。在其他实施方案中，所述产物细胞是单子叶植物细胞。在另外的实施方案中，所述产物细胞选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦和高粱植物细胞。在一些实施方案中，可操作地连接至编码位点特异性核酸酶的序列的所述第一启动子是组成型启动子、组织特异性或组织优选的启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。在其他实施方案中，所述位点特异性核酸酶是锌指核酸酶(zfn)、大范围核酸酶、rna指导的核酸内切酶、tale核酸内切酶(talen)、重组酶或转座酶。在另外的实施方案中，所述位点特异性核酸酶是rna指导的核酸酶。在一些实施方案中，所述培养基还包含第一重组dna构建体，所述第一重组dna构建体包含编码可操作地连接至启动子的向导rna分子的第一可转录dna序列。在另外的实施方案中，可操作地连接至所述第一可转录dna序列的所述启动子是组成型启动子、组织特异性或组织优选的启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，所述培养基还包含供体模板分子或第二重组dna构建体，所述第二重组dna构建体包含编码可操作地连接至启动子的供体模板分子的第二可转录dna序列。在另外的实施方案中，所述供体模板分子包含转基因，所述转基因包含可操作地连接至植物可表达的启动子的编码序列或可转录dna序列。在另外其他实施方案中，可操作地连接至所述第二可转录dna序列的所述启动子是组成型启动子、组织特异性或组织优选的启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，所述第二植物细胞培养物的一种或多种细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含编码可操作地连接至启动子的向导rna分子的第一可转录dna序列。在其他实施方案中，所述受体植物细胞培养物的所述受体细胞包含供体模板分子或重组dna构建体，所
述重组dna构建体包含编码可操作地连接至启动子的供体模板分子的第二可转录dna序列。在另外的实施方案中，所述供体模板分子包含转基因，所述转基因包含可操作地连接至植物可表达的启动子的编码序列或可转录dna序列。本文还提供了通过本文所述的方法产生的经编辑的产物细胞。在一些实施方案中，所述经编辑的产物细胞是双子叶植物细胞。在其他实施方案中，所述经编辑的产物细胞是单子叶植物细胞。本发明还提供了从通过本文所述的方法产生的经编辑的产物细胞再生或发育的植物。在一些实施方案中，所述再生的植物是双子叶植物或单子叶植物。本文还提供了所述再生的植物的种子、子代植物或子代种子。本文还提供了通过本文所述的方法产生的受伤的经混合的细胞培养物。
17.在另一个方面，本发明提供了一种用于编辑植物细胞的方法，所述方法包括：a)将包含受体细胞的受体植物细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物，其中所述生物分子包括位点特异性核酸酶或包含编码可操作地连接至第一启动子的位点特异性核酸酶的序列的重组dna分子；b)使所述经混合的细胞培养物的所述受体细胞受伤，以产生至少一种具有通过所述位点特异性核酸酶引入它的基因组中的编辑或突变的经编辑的产物细胞；以及c)筛选或选择具有所述编辑或突变的所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞，或者从所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞发育或再生的植物。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：d)从所述经混合的细胞培养物和/或所述至少一种经编辑的产物细胞或其至少一种子代细胞再生植物。
18.在又一个方面，本发明提供了一种用于编辑植物细胞的方法，所述方法包括：a)将包含受体细胞的受体植物细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物，其中所述生物分子包括位点特异性核酸酶或包含编码可操作地连接至第一启动子的位点特异性核酸酶的序列的重组dna分子；b)使所述经混合的细胞培养物的所述受体细胞受伤，以产生至少一种具有通过所述位点特异性核酸酶引入它的基因组中的编辑或突变的经编辑的产物细胞；以及c)从所述经混合的细胞培养物和/或所述至少一种经编辑的产物细胞或其至少一种子代细胞再生植物。
19.本发明提供了一种用于编辑植物细胞的方法，所述方法包括：a)使受体植物细胞培养物的受体细胞受伤；以及b)将所述受体植物细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物，其中所述生物分子包括位点特异性核酸酶或包含编码可操作地连接至第一启动子的位点特异性核酸酶的序列的重组dna分子，以产生至少一种具有通过所述位点特异性核酸酶引入它的基因组中的编辑或突变的经编辑的产物细胞。在一些实施方案中，根据通过所述编辑或突变产生的以及存在于所述发育或再生的植物或其子代植物、植物部分或种子中的性状或表型来筛选或选择从所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞发育或再生的所述植物。在其他实施方案中，根据分子测定法来筛选或选择所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞、或者从所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞发育或再生的所述植物。在一些实施方案中，所述受体植物细胞培养物、培养基或经混合的细胞培养物还包含渗压剂。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：c)在步骤a)或步骤b)之前、期间或之后，将渗压剂添加至所述受体植物细胞培养物、培养基或经混合的细胞培养物中。在另外的实施方案中，所述渗压剂包括聚乙二醇(peg)。在其他实施方案中，所述受体植物细胞培养物是愈伤组织培养物或细胞
悬浮培养物。在一些实施方案中，所述受体植物细胞培养物的细胞是双子叶植物细胞。在另外的实施方案中，所述双子叶植物细胞选自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、芸苔和棉花细胞。在其他实施方案中，所述受体植物细胞培养物的细胞是单子叶植物细胞。在另外的实施方案中，所述单子叶植物细胞选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦、大麦和高粱细胞。本发明还提供了通过本文所述的方法产生的产物细胞。在一些实施方案中，所述产物细胞是双子叶植物细胞。在另外的实施方案中，所述产物细胞选自由以下组成的组：烟草、番茄、大豆、芸苔和棉花植物细胞。在其他实施方案中，所述产物细胞是单子叶植物细胞。在另外的实施方案中，所述产物细胞选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦和高粱植物细胞。在一些实施方案中，可操作地连接至编码位点特异性核酸酶的序列的所述第一启动子是组成型启动子、组织特异性或组织优选的启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。在其他实施方案中，所述位点特异性核酸酶是锌指核酸酶(zfn)、大范围核酸酶、rna指导的核酸内切酶、tale核酸内切酶(talen)、重组酶或转座酶。在另外的实施方案中，所述位点特异性核酸酶是rna指导的核酸酶。在一些实施方案中，所述培养基还包含第一重组dna构建体，所述第一重组dna构建体包含编码可操作地连接至启动子的向导rna分子的第一可转录dna序列。在另外的实施方案中，可操作地连接至所述第一可转录dna序列的所述启动子是组成型启动子、组织特异性或组织优选的启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，所述培养基还包含供体模板分子或第二重组dna构建体，所述第二重组dna构建体包含编码可操作地连接至启动子的供体模板分子的第二可转录dna序列。在另外的实施方案中，所述供体模板分子包含转基因，所述转基因包含可操作地连接至植物可表达的启动子的编码序列或可转录dna序列。在另外其他实施方案中，可操作地连接至所述第二可转录dna序列的所述启动子是组成型启动子、组织特异性或组织优选的启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，所述第二植物细胞培养物的一种或多种细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含编码可操作地连接至启动子的向导rna分子的第一可转录dna序列。在其他实施方案中，所述受体植物细胞培养物的所述受体细胞包含供体模板分子或重组dna构建体，所述重组dna构建体包含编码可操作地连接至启动子的供体模板分子的第二可转录dna序列。在另外的实施方案中，所述供体模板分子包含转基因，所述转基因包含可操作地连接至植物可表达的启动子的编码序列或可转录dna序列。本文还提供了通过本文所述的方法产生的经编辑的产物细胞。在一些实施方案中，所述经编辑的产物细胞是双子叶植物细胞。在其他实施方案中，所述经编辑的产物细胞是单子叶植物细胞。本发明还提供了从通过本文所述的方法产生的经编辑的产物细胞再生或发育的植物。在一些实施方案中，所述再生的植物是双子叶植物或单子叶植物。本文还提供了所述再生的植物的种子、子代植物或子代种子。本文还提供了通过本文所述的方法产生的受伤的经混合的细胞培养物。
20.在另一个方面，本发明提供了一种用于编辑植物细胞的方法，所述方法包括：a)使受体植物细胞培养物的受体细胞受伤；b)将所述受体植物细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物，其中所述生物分子包括位点特异性核酸酶或包含编码可操作地连接至第一启动子的位点特异性核酸酶的序列的重组dna分子，以产生至少一种具有通过所述位点特异性核酸酶引入它的基因组中的编辑或突变的经编辑的产物细胞；以及c)筛选或选择具有所述编辑或突变的所述至少一种
经编辑的产物细胞或其子代细胞，或者从所述至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞发育或再生的植物。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：d)从所述经混合的细胞培养物和/或所述至少一种经编辑的产物细胞或其至少一种子代细胞再生植物。
21.在另一个方面，本发明提供了一种用于编辑植物细胞的方法，所述方法包括：a)使受体植物细胞培养物的受体细胞受伤；b)将所述受体植物细胞培养物与包含至少一种生物分子的培养基混合，以获得包含所述受体细胞的经混合的细胞培养物，其中所述生物分子包括位点特异性核酸酶或包含编码可操作地连接至第一启动子的位点特异性核酸酶的序列的重组dna分子，以产生至少一种具有通过所述位点特异性核酸酶引入它的基因组中的编辑或突变的经编辑的产物细胞；以及c)从所述经混合的细胞培养物和/或所述至少一种经编辑的产物细胞或其至少一种子代细胞再生植物。
附图说明
22.图1：示出了插入到转基因玉米品系a的核基因组中的gfp报告基因构建体中的组件。在5’至3’方向上，具有增强的camv 35s启动子和5’非翻译区中的hsp70内含子，侧接有两个lox位点的nptii可选择的标记基因盒，然后是绿色荧光蛋白(gfp)编码基因。在不存在cre重组酶的情况下，由于在35s启动子和gfp编码序列之间插入了nptii基因，gfp不能在功能上表达。然而，在存在cre重组酶的情况下，由于侧接lox位点而使nptii基因被切除，这导致了高水平的gfp表达。
23.图2：图2a
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c示出了在3周培养后鉴定的第一gfp阳性愈伤组织块的图像。图2d和2e示出了从由gfp阳性愈伤组织再生的植株获得的叶子中的gfp表达的图像。
24.图3：示出了使用被设计用于扩增gfp报告基因构建体的引物获得的pcr结果。使用本领域已知的ctab方法，从采集自植株1
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3和植株4的叶子组织中分离基因组dna，植株1
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3是从gfp阳性愈伤组织再生的，植株4是gfp阴性对照植株。进行pcr反应，并且在1％琼脂糖凝胶中解析来自这些反应的pcr产物。与未切除的dna片段的～2.18kb条带相比，通过切除的dna片段的～0.97kb条带的存在来确认nptii基因盒的cre切除。
25.图4：图4a示出了再生的gfp阳性(植株1
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3)和阴性(植株4)植株的图像。图4b示出了在蓝光下在植株2(它是gfp阳性植株)的雄花小穗中观察到的gfp表达。图4c示出了来自植株4(gfp阴性对照)的雄花小穗中的gfp表达。
26.图5：示出了在培养基1074中培养至少三天的细胞中的gfp表达。图5a和5b示出了仅在含有在三天培养后用peg处理共混愈伤组织悬浮液的平板中观察到gfp表达。图5c示出了仅在含有在六天培养后用peg处理的共混愈伤组织悬浮液的平板中观察到gfp表达。在未用peg处理的具有cre的愈伤组织的平板中未发现gfp表达。
具体实施方式
27.本公开提供了用于将遗传物质、多核苷酸、dna、蛋白质、核酸酶和/或核糖核蛋白引入、转移或递送(即，转移)至植物细胞和组织中，以产生具有所期望的突变、编辑、基因型和/或表型或性状的细胞或植物的新方法和组合物。本领域需要一种用于将生物分子引入、转移或递送(即，转移)至一种或多种植物细胞中，以在所述一种或多种植物细胞中产生遗传变化、突变或编辑，从而在从所述一种或多种植物细胞发育或再生的植物中产生所期望
的基因型、表型或性状的高效和有效的技术。如本文所用，将生物分子转移、递送和/或引入受体细胞中统称为将生物分子“转移(transfer或transferring)”至受体细胞中，并且同样地被转移、递送和/或引入受体细胞中的生物分子统称为被“转移”至受体细胞中的生物分子。
28.本公开描述了将生物分子引入、转移或递送(即，转移)至植物细胞或植物细胞群(诸如，亲本植物细胞)中的方法，所述植物细胞或植物细胞群可以在体外生长，例如作为愈伤组织或细胞悬浮培养物，所述方法可以伴随着培养中的这些细胞或组织的受伤，以及由培养中的这些细胞或组织的受伤辅助。生物分子的这种引入、递送或转移(即，转移)可以引起突变、编辑或其他遗传变化的产生，从而导致在植物细胞或植物细胞群中，或者在从这些植物细胞发育、生长或再生的植物或植物部分中产生新基因型、特征、表型和/或性状。不受理论的束缚，植物细胞的受伤，例如通过用剃刀片、小刀或其他锋利工具切碎，或者通过超声、涡旋、振荡、共混、电穿孔或其他手段，可以破坏一个或多个植物细胞的植物细胞壁和/或质膜或者在一个或多个植物细胞的植物细胞壁和/或质膜中产生开口或孔，从而允许存在于一个或多个植物细胞的环境或外界中的生物分子(例如，培养基、溶液或混合物)从所述环境或外界进入、被引入、被递送或被转移至一个或多个植物细胞中，以形成在细胞质、胞质溶胶、细胞器或细胞核内具有一种或多种生物分子的产物细胞。不受理论的束缚，质膜和/或细胞壁可以在有限程度上被破坏或打开，以使得植物细胞保持活力并且能够分裂和形成子代或子代植物细胞，所述子代或子代植物细胞可以继续进一步分裂、发育和分化以形成植物或植物部分。根据一些实施方案，生物分子可以具有信号或靶向序列或标签，这些信号或靶向序列或标签可以融合至生物分子，它们的功能是使生物分子靶向植物产物细胞的特定区室(例如，细胞核、叶绿体、线粒体等)。根据一些实施方案，还可以采用促进细胞渗透的一种或多种试剂，诸如使用不同的渗压剂(例如，聚乙二醇(peg)、糖、糖醇等)，提供高钙(或其他阳离子)浓度、高ph和/或已知在其他方法中促进细胞膜融合的其他化合物和条件，所述试剂可以帮助将一种或多种生物分子引入、递送或转移(即，转移)至植物细胞中。然后也许可以通过筛选或选择产物细胞或其子代中存在的标记基因(转基因或非转基因)，或者通过产生新性状、基因型或标记表达，或者通过突变、编辑或其他遗传变化的分子检测来使通过本发明的方法产生的产物细胞或产物细胞群生长、发育和/或再生。然后可以根据新性状、表型或者性状或表型的组合(诸如一个或多个遗传性状和/或标记)来鉴定、分离或选择从这些产物细胞生长或再生的植物。
29.本文提供了一种将一种或多种生物分子引入、递送或转移(即，转移)至靶标或受体植物细胞、靶标或受体植物细胞群、或者来自两个或更多个亲本类型、变种、种质或基因型的混合靶标或受体细胞群的方法，所述细胞或细胞群可以例如作为愈伤组织或细胞悬浮液在体外生长。此类生物分子至靶标或受体植物细胞的转移通过使靶标或受体愈伤组织细胞或者细胞悬浮液或者细胞团块或群集受伤来进一步促进。不受理论的束缚，根据本发明的方法将一种或多种生物分子转移至靶标或受体植物细胞可以不需要原生质体化、胞间连丝形成，也不需要不同的植物细胞或组织的成功植入。
30.如以下实例所述，将具有gfp报告基因构建体的无组织生长的玉米或玉米组织(愈伤组织)受伤，并且在周围培养基中与cre重组酶蛋白酶混合，所述gfp报告基因构建体被lox位点侧接的nptii标记基因盒打断。使愈伤组织玉米细胞受伤允许cre重组酶进入细胞，
尤其是在存在一种或多种渗压剂或渗压试剂的情况下，并且通过作用于侧接的lox位点来引起nptii标记基因的切除，以使35s启动子接近gfp编码序列，从而通过gfp报告基因的表达来产生可检测的荧光。gfp阳性细胞和组织通过这些方法来产生，这表明cre重组酶被有效地引入、转移或递送(即，转移)至靶标或受体愈伤组织细胞中。除gfp表达之外，分子分析还通过基于pcr片段大小的nptii基因盒的切除来进一步确认cre重组酶在靶标或受体愈伤组织细胞中的存在。
31.本公开提供了用于通过将一种或多种生物分子递送至受伤的一种或多种靶标或受体植物细胞或者植物细胞群体(所述递送可以在存在一种或多种渗压试剂的情况下进行)来产生一种或多种突变、编辑或遗传修饰的植物细胞或植物细胞群的方法，以及这样的一种或多种突变、编辑或遗传修饰的植物细胞(或产物细胞)或者一种或多种植物细胞或产物细胞群的组合物(或包含它们的组合物)。这些方法的受体和/或产物细胞可以包含一个或多个独特或不同的转基因、标记、重组事件、插入、缺失、突变、编辑等。这些方法可以允许一种或多种蛋白质、一种或多种核糖核酸蛋白、一种或多种多核苷酸、一种或多种dna分子、一种或多种遗传物质或一种或多种其他生物分子或者它们的任何组合的有效引入、转移或递送(即，转移)，以进行受体或靶细胞的突变、编辑或其他遗传变化。在某些实施方案中，靶标、受体和/或产物植物细胞是双子叶植物细胞，诸如来自烟草、番茄、大豆、棉花、芸苔、苜蓿、甜菜、拟南芥或其他水果和蔬菜。在其他实施方案中，靶标、受体和/或产物植物细胞可以来自单子叶植物，诸如来自玉米、小麦、水稻、高粱、大麦或其他谷物植物和蔬菜。靶标、受体细胞和/或产物细胞可以来自体外生长的细胞培养物，诸如细胞悬浮液或愈伤组织培养物，它们可以是可再生的愈伤组织培养物。靶标、受体和/或产物细胞、愈伤组织或细胞悬浮液是不可再生的也是可能的，虽然一种或多种靶标、受体和/或产物细胞可再生为植物或植物部分通常是优选的。
32.如本文所用，“产物细胞”是通过本公开的方法或实验产生的细胞，所述细胞具有从环境或外界引入、转移或递送(即，转移)的一种或多种生物分子，并且可以具有一种或多种突变、一种或多种编辑和/或一种或多种其他遗传变化。在一些实施方案中，“产物细胞”是指通过本公开的方法或实验产生的细胞，所述细胞具有通过从环境或周围培养基、溶液等递送的位点特异性核酸酶，或者通过从引入受体细胞中的一种或多种多核苷酸表达的位点特异性核酸酶和/或向导rna，或者通过从引入受体细胞中的一种或多种多核苷酸表达的位点特异性核酸酶与从已经存在或预先存在于受体细胞中的构建体或表达盒表达的向导rna结合引入的编辑或靶向(定点)插入。“编辑”是指相对于未经历这种“编辑”的另外相同的植物细胞或植物(诸如亲本或受体植物细胞或植物)的对应基因组序列，所得的或产物植物细胞的核基因组序列中，以及从这种产物植物细胞或其子代植物发育或再生的植物中，以及来自前述中的任一者的植物部分或种子中的变化(例如，插入、缺失、取代、倒位等)。这种编辑可以在植物基因组的基因间区域或植物基因组的基因区域内，诸如在存在于受体细胞中的天然基因或转基因之处或附近(例如，在增强子、启动子、剪接位点、编码序列、外显子、内含子、5'或3'非翻译区(utr)、终止子等中)，以影响这种基因或转基因的表达和/或活性。产物细胞和植物及其子代可以具有与受体植物或植物细胞相似或相同的基因型、性状和/或表型，包括形态和生殖性状，这是由于生物分子被引入、递送或转移(即，转移)至受体细胞中而产生的相对较小的遗传修饰，以及产物细胞保留受体细胞的大部分或全部细胞
核、线粒体和/或质体基因组、细胞组分和遗传背景，但是通过将一种或多种生物分子转移至一种或多种受体细胞中而产生的一种或多种突变、一种或多种编辑和/或一种或多种基因修饰除外。
33.受伤可以通过本领域已知的方法来实现。例如，用剃刀片、小刀或其他锋利工具切碎或切割细胞，以及通过超声来受伤可以是有效的。受伤也可以通过涡旋、振荡、共混、电穿孔或其他机械手段来实现。不受理论的束缚，植物细胞的受伤可以在植物细胞壁中产生开孔或孔，增加质膜的渗透性，和/或增加一种或多种受体细胞对周围培养基的摄取。在受伤或修复过程中，植物细胞可以摄取和保持一定含量的周围培养基、混合物或溶液，包括存在于周围培养基或环境中的任何一种或多种生物分子或其他组分。
34.一旦受伤的细胞培养物产生和暴露或与含有一种或多种生物分子的培养基、溶液或混合物混合，就可以在产物细胞培养物及其子代和/或从前述再生的植物或植物部分的生长和再生期间和/或之后，对所期望的遗传修饰、性状或标记或者所期望的遗传性状和/或标记的组合的存在进行选择或筛选，以选择或筛选具有生物分子和/或至少一种所期望的突变、编辑和/或遗传修饰的细胞、植物或植物部分。在某些实施方案中，在使一种或多种受体细胞受伤和/或暴露于一种或多种生物分子后进行选择，这可以在使受体细胞培养物受伤后和/或稍后立即进行(例如，即使在制备受伤的细胞群同时)。选择可以例如通过在一种或多种培养基中掺入有效量的选择剂来进行。
35.如本文所用，“生物分子”是指根据本文所述的方法可以被引入受伤的受体植物细胞中的任何生物分子，可能还包括一种或多种其他生物分子。生物分子(或者两种或更多种生物分子的组合)通常将是当被引入、递送或转移(即，转移)至受体植物细胞中时，可以直接或间接对受体植物细胞的基因组引起或产生一种或多种突变、一种或多种编辑和/或一种或多种其他遗传变化的生物分子(或者两种或更多种生物分子的组合)。生物分子的实例可以包括核酸酶，诸如位点特异性核酸酶、重组酶、核糖核蛋白、向导rna或者包含一个或多个编码前述中的任何一者或多者的序列的重组多核苷酸或dna分子。生物分子可以是位点特异性核酸酶，位点特异性核酸酶是锌指核酸酶(zfn)、大范围核酸酶、rna指导的核酸内切酶、tale核酸内切酶(talen)、重组酶或转座酶、向导rna或供体dna模板分子或者包含一个或多个编码前述中的任何一者或多者的序列的重组多核苷酸或dna分子。为清晰起见，一种或多种生物分子、两种或更多种生物分子等可以根据本发明的方法转移至受体细胞中，和/或在一种或多种生物分子转移至受体细胞中之前，受体细胞可以已经具有或表达一种或多种生物分子。
36.在某些实施方案中，可能期望采用转基因或突变性状或标记来选择或筛选。此类性状可以例如包括抗生素或除草剂耐受性，诸如对卡那霉素、链霉素、壮观霉素、潮霉素、草甘膦、草铵膦、麦草畏等的抗性。这些性状可以是质体编码的或核编码的。可用于选择或筛选的其他性状可以包括导致产生肉眼可检测的表型或产物，诸如gus、gfp或类胡萝卜素(诸如八氢番茄红素)等的那些。此类性状或标记可以通过生物分子(即包含可选择的标记基因或表达盒的多核苷酸)来引入，或者可以在一种或多种生物分子的引入之前存在于一种或多种受体细胞中。
37.在将一种或多种受体或靶标植物细胞与生物分子混合之前或之后，以及可能地在将一种或多种受体或靶标植物细胞与渗压剂混合之前或之后，使体外生长的受体或靶标植
物细胞或者受体或靶细胞群受伤，可以使一种或多种包含生物分子的产物细胞处于一种或多种产物细胞内部，从而可以在一种或多种产物细胞的一种或多种基因组中产生一种或多种突变、一种或多种编辑和/或一种或多种其他遗传变化。
38.术语“转基因”是指外源引入生物体的至少一种细胞中的dna分子或构建体，所述dna分子或构建体作为人工干预(诸如通过植物转化方法)的结果而掺入生物体的基因组中。如本文所用，术语“转基因”是指包含转基因或重组表达盒或构建体的材料。例如，“转基因植物”是指在基因组中包含转基因或重组表达盒或构建体的植物，而“转基因性状”是指由于掺入植物基因组的转基因或重组表达盒或构建体的存在而引起、传送或赋予的植物的特征或表型。由于这种基因组改变，转基因植物与相关的野生型植物明显不同。根据多个实施方案，转基因可以包含可操作地连接至启动子(诸如植物可表达的启动子)的编码序列或可转录dna序列。植物可表达的启动子可以在一种或多种植物细胞(诸如根据本公开的受体和/或产物细胞)中表达。植物可表达的启动子可以是组成型启动子、组织特异性或组织优选的启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。根据多个实施方案，转基因的可转录dna序列或编码序列可以编码所关注的rna或蛋白质，诸如结构蛋白、酶、rna抑制元件或针对位点特异性核酸酶的向导rna。根据一些实施方案，转基因的编码序列可以包含标记基因的编码序列，所述编码序列可以存在于细胞核或质体基因组中。标记基因可以是如本文进一步描述的可选择的标记基因或可筛选的标记基因。根据一些实施方案，转基因的编码序列可以编码位点特异性核酸酶。
39.如本文所用以及根据通常理解的含义，“对照”意指出于比较目的而设计的实验对照，它通常类似于实验或测试对象，不同之处在于所测试或研究的一个或多个差异或修饰。例如，对照植物可以是与具有一种或多种所关注的修饰(例如，转基因、突变、编辑等)的实验或测试植物相同或相似类型的植物，所述对照植物不含有一种或多种存在于实验植物中的修饰。
40.转基因、突变或经编辑的植物
41.本发明的一个方面包括转基因植物细胞、转基因植物组织、转基因植物和包含转基因或重组dna分子的转基因种子，其中所述转基因在受伤和/或生物分子的引入或通过根据本发明的方法引入生物分子之前可以存在于受体细胞中。这些包含重组dna分子、转基因、构建体、盒等的细胞、组织、植物和种子可以表现出对选择剂(诸如一种或多种除草剂或抗生素)的耐受性，或者提供可筛选的标记或所关注的另一种表型或性状，诸如所关注的农艺性状。根据一些实施方案，在本公开的方法或实验中使用或产生的植物细胞可以是转基因植物细胞，它可以来源于转基因植物。
42.可以使用任何合适的转化方法来产生转基因细胞、植物部分或植物，并且转基因受体细胞可以来源于这种转基因细胞、植物部分或植物。在本公开的方法中使用的一种或多种受体细胞可以包括通过这些方法产生的一种或多种转基因植物细胞。植物细胞的转化方法包括可以将dna引入细胞中(例如，将重组dna构建体稳定整合进植物染色体中)的任何方法。植物转化的方法是本领域已知的。用于将重组dna构建体引入植物的方法可以包括细菌介导的(或农杆菌介导的)转化或用于转化的粒子轰击技术，这两种方法都是本领域的技术人员熟知的。可以用于将重组dna构建体作为转基因引入植物的另一种方法是通过定点整合的方法将重组dna构建体插入植物基因组中的预定位点。定点整合可以通过本领域已
知的任何方法来实现，例如通过使用锌指核酸酶、工程化或天然大范围核酸酶、tale核酸内切酶或rna指导的核酸内切酶(例如，crispr/cas9系统)与用于在期望的靶位点进行基因组插入的模板dna组合来实现。因此，定点整合可以用于将转基因引入基因组中所期望的位置。用于培养外植体和植物部分的方法以及用于选择和再生培养中的植物的方法也是本领域已知的。或者，本公开的方法可以用于通过将一种或多种生物分子引入、转移或递送(即，转移)至受体植物细胞中来将转基因递送或插入受体植物细胞的基因组中，所述方法的功能是产生所期望的突变、编辑、转基因插入或其他基因修饰。
43.一旦通过任一种已知的技术(诸如细菌或农杆菌介导的转化、粒子轰击或基因组编辑(包括定点整合)或使用本公开的生物分子递送方法)来转化植物细胞，转基因植物就可以通过任何已知的植物细胞、组织或外植体培养方法从转化的植物细胞、组织或植物部分发育或再生。对于突变、编辑、等位基因或转基因纯合(即，具有两个拷贝的突变、编辑、等位基因或转基因)的转基因植物可以通过使突变的、经编辑的或转基因植物(含有自身的单个突变、编辑或转基因等位基因)(例如r0植物)自花传粉(自交)以产生r1种子来获得。可以使用任何已知的接合性测定法来测试转基因、突变或经编辑的子代(诸如从r1种子生长的植物)的接合性，诸如通过使用snp测定法、dna测序、热扩增或pcr和/或dna印迹，这些方法能够区分杂合子、纯合子和野生型，或者通过观察或选择根据接合性预期的表型或性状。
44.如本文提供的含有一种或多种新突变、一种或多种编辑、一种或多种转基因和/或一种或多种性状或者它们的新组合的植物和子代，可以与本领域熟知的任何繁育方法一起使用。通常用于不同性状和作物的繁育或杂交植物的方法是本领域的技术人员已知的。通过将一种或多种生物分子引入一种或多种具有所期望的遗传背景、种质或基因型的受体植物细胞中，本公开的方法可以用作另外的繁育工具，但是通过将一种或多种生物分子引入一种或多种受体植物细胞而引起或产生的另外的突变、编辑、转基因或其他遗传修饰除外。实际上，本公开的方法可以用于将与基因组中的另一种所期望的性状、标记、基因或序列紧密连接或相关的突变、编辑、转基因或其他遗传修饰引入基因组中的位点处，这可以是很难通过常规繁育、基因渗入和回交转化组合的。转基因性状已种质渗入其中之植物基因型可被称为回交转化的基因型、系、近交种或杂交种。类似地，缺乏所期望的转基因性状的植物基因型等可称为未转化的基因型、品系、近交种或杂交种。
45.本公开的方面可以用于繁育或基因渗入工作，作为通过有性繁殖来杂交植物的替代方法，以允许组合产物细胞中的遗传性状和/或细胞组分的组合，所述组合产物细胞可以发育或再生为具有所期望的组合或性状引入的植物。可以根据一种或多种突变、编辑、转基因、标记、性状或表型的存在来鉴定或选择此类植物。为了确认一种或多种转基因、一种或多种突变、一种或多种编辑、或者一种或多种其他遗传变化、或者一种或多种性状存在于植物、植物部分或者它们的种子或子代(诸如从如本文提供的产物细胞、或者它们的植物部分、种子或子代再生的植物)中，可以进行和使用多种测定法。此类分析可以包括例如分子生物学分析，诸如dna和rna印迹、pcr以及dna测序；生物化学分析，诸如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫手段(elisa和蛋白质印迹)或通过酶功能；植物部分分析，诸如叶或根分析；以及通过分析整个植物的表型或性状。
46.基因编辑和重组
47.根据本发明的方法将一种或多种生物分子引入、转移或递送(即，转移)至受体细
胞或受体细胞培养物或受体细胞群中的能力提供了引入、转移或递送(即，转移)存在于受体植物细胞的周围培养基中的rna、蛋白质和/或其他分子或因子的潜力。可以将这些生物分子引入、转移或递送至受体细胞中，而不整合进受体细胞的基因组dna中。因此，可以根据本发明的方法将rna和/或蛋白质引入、转移或递送至受体细胞中，并且对受体细胞施加活性、作用或变化。引入、转移或递送的rna、蛋白质或其他生物分子或者它们的组合可以短暂地存在于受体细胞中，虽然当一种或多种生物分子存在于受体细胞中时，可以引起受体细胞的基因组的一种或多种遗传变化。因此，rna、蛋白质和/或一种或多种其他生物分子只能在有限的时间内存在于受体细胞中，这取决于从周围培养基转移至受体细胞后在受体细胞中的起始浓度及其在受体细胞中的稳定性或半衰期。
48.在不将编码rna和/或蛋白质的一种或多种转基因转化、整合或掺入受体细胞基因组的情况下，将rna和/或蛋白质递送至受体细胞的能力，可以通过将rna和/或蛋白质从周围培养基递送至靶标或受体细胞来对非转基因受体细胞基因组进行改变(即，不使用转基因转化受体细胞的基因组)。除cre重组酶之外，其他酶也可以递送至受体细胞，以改变受体细胞的基因组或dna。根据一些实施方案，位点特异性核酸酶，诸如锌指核酸酶、大范围核酸酶、rna指导的核酸酶、tale核酸酶、重组酶、转座酶或它们的任何组合，可以经由本公开的方法引入、转移或递送(即，转移)至受体细胞中，这可以涉及使受体细胞受伤和/或使它们暴露于渗压剂中。在一些实施方案中，rna指导的核酸酶是crispr相关核酸酶(crispr相关核酸酶的非限制性实例包括例如cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1和csx12)、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、cpf1、casx、casy、它们的同源物或它们的经修饰的形式)。在一些实施方案中，将rna指导的核酸酶和向导rna、或者编码rna指导的核酸酶和向导rna中的一者或二者的一个或多个dna分子递送至受体细胞，以对受体细胞dna进行改变。在一些实施方案中，将rna指导的核酸酶或编码rna指导的核酸酶的dna分子递送至已经表达向导rna的受体细胞，所述向导rna与rna指导的核酸酶复合以对受体细胞dna进行改变。在一些实施方案中，将向导rna或编码向导rna的dna分子递送至已经表达rna指导的核酸酶的受体细胞，所述rna指导的核酸酶与向导rna复合以对受体细胞dna进行改变。在一些实施方案中，受体细胞可以另外包含供体dna序列。在一些实施方案中，供体dna序列是用于模板编辑的模板。在其他实施方案中，供体dna序列包含转基因或重组dna构建体。突变、经编辑的或转基因产物细胞是通过将位点特异性核酸酶引入、转移或递送(即，转移)至受体细胞中来产生，所述受体细胞可以再生为基因组中具有突变、编辑或转基因的植物，并且子代植物、植物部分和种子也可以来源于再生的植物。在多个实施方案中，从突变、经编辑的或转基因产物细胞再生的植物可以在遗传上和表型上类似于从受体细胞来源的植物，但是由基因组编辑或突变或转基因产生的任何一种或多种性状和/或一种或多种表型除外。
49.根据多个这些实施方案，提供了一种用于突变或编辑植物细胞的方法，所述方法包括：将受体植物细胞培养物与至少一种生物分子混合或组合，其中所述至少一种生物分子可以存在于受体细胞周围培养基中，其中所述受体植物细胞培养物的一种或多种细胞包含重组dna转基因，所述重组dna转基因包含编码可操作地连接至第一启动子的位点特异性
核酸酶的序列；以及使受体细胞培养物的细胞受伤，以产生至少一种具有通过位点特异性核酸酶引入它的基因组中的编辑或突变的经编辑的产物细胞。此类方法还可以包括筛选或选择具有编辑或突变的至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞、或者从至少一种经编辑的产物细胞或其子代细胞发育或再生的植物，所述方法可以基于分子测定法或者通过编辑或突变产生，并且存在于从经编辑的产物细胞或其子代细胞发育或再生的植物中，或者存在于它们的子代植物、植物部分或种子中的性状或表型。在这些方法中，受体细胞培养物可以是愈伤组织培养物或细胞悬浮培养物。这些方法可以另外包括从至少一种经编辑的产物细胞或它们的至少一种子代细胞再生植物。这些方法中使用的植物细胞可以是单子叶植物或双子叶植物细胞。
50.根据一些实施方案，生物分子可以是包含第一重组dna构建体的多核苷酸，所述第一重组dna构建体包含编码可操作地连接至启动子的向导rna分子的第一可转录dna序列。根据一些实施方案，生物分子可以是包含第二重组dna构建体的多核苷酸，所述第二重组dna构建体包含编码可操作地连接至启动子的供体模板分子的第二可转录dna序列。根据一些实施方案，这些方法中的一种或多种受体植物细胞可以另外包含第一重组dna构建体，所述第一重组dna构建体包含编码可操作地连接至启动子的向导rna分子的第一可转录dna序列。根据一些实施方案，这些方法中的一种或多种受体植物细胞可以另外包含第二重组dna构建体，所述第二重组dna构建体包含编码可操作地连接至启动子的供体模板分子的第二可转录dna序列。
51.还提供了通过这些方法产生的转基因、突变或经编辑的植物细胞及其子代细胞，所述细胞可以是单子叶植物或双子叶植物细胞，并且可以各自进一步发育或再生为转基因、突变或经编辑的植物。还提供了发育的或再生的植物或其子代植物的种子或植物部分。此外，还提供了在本发明的方法中使用的受伤的受体细胞和通过这些方法产生的产物细胞。
52.本文提供的位点特异性核酸酶可以选自由以下组成的组：锌指核酸酶(zfn)、大范围核酸酶、rna指导的核酸内切酶、tale核酸内切酶(talen)、重组酶、转座酶或它们的任何组合。参见例如khandagale,k.等人,“genome editing for targeted improvement in plants,”plant biotechnol rep 10:327
‑
343(2016)；和gaj,t.等人,“zfn,talen and crispr/cas
‑
based methods for genome engineering,”trends biotechnol.31(7):397
‑
405(2013)，这些文献的内容和公开内容以引用的方式并入本文。重组酶可以是与dna识别基序连接的丝氨酸重组酶、与dna识别基序连接的酪氨酸重组酶或本领域已知的其他重组酶。重组酶或转座酶可为与dna结合结构域连接的dna转座酶或重组酶。连接至dna识别基序的酪氨酸重组酶可以选自由以下组成的组：cre重组酶、flp重组酶和tnp1重组酶。根据一些实施方案，cre重组酶或gin重组酶可以被栓系至锌指dna结合结构域。在另一个实施方案中，本文提供的与dna识别基序连接的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：phic31整合酶、r4整合酶和tp
‑
901整合酶。在另一个实施方案中，本文提供的与dna结合结构域连接的dna转座酶选自由以下组成的组：tale
‑
piggybac和tale
‑
突变子(mutator)。
53.根据本公开的实施方案，rna指导的核酸内切酶可以选自由以下组成的组：cas9或cpf1。根据本公开的其他实施方案，rna指导的核酸内切酶可以选自由以下组成的组：cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1和csx12)、cas10、csy1、
csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、cpf1、casx、casy以及它们的同源物或经修饰的形式、argonaute(argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌(thermus thermophilus)argonaute(ttago)、激烈热球菌(pyrococcus furiosus)argonaute(pfago)、格氏嗜盐碱杆菌(natronobacterium gregoryi)argonaute(ngago)以及它们的同源物或经修饰的形式)。根据一些实施方案，rna指导的核酸内切酶可以是cas9或cpf1酶。对于rna指导的核酸内切酶，可以进一步提供向导rna(grna)分子，以通过碱基配对或杂交将核酸内切酶引导至植物基因组中的靶位点，从而在靶位点处或附近产生dsb或切口。grna可以作为grna分子，或作为包含可操作地连接至启动子或植物可表达的启动子的编码向导rna的可转录dna序列的重组dna分子、构建体或载体来转化或引入到受体植物细胞或组织中。启动子可为组成型启动子、组织特异性或组织优选启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。如本领域所理解，“向导rna”可以包括例如crispr rna(crrna)、单链向导rna(sgrna)或可以将核酸内切酶指导或引导至基因组中的特定靶位点的任何其他rna分子。“单链向导rna”(或“sgrna”)是包含通过接头序列共价连接tracrrna的crrna的rna分子，它可以作为单个rna转录物或分子表达。向导rna包含与植物基因组内(诸如在基因处或附近)的靶位点相同或互补的向导或靶向序列。如本领域所已知，前间隔序列邻近基序(pam)可以存在于紧邻基因组靶位点序列的5'端并且在其上游的基因组中，所述基因组靶位点序列与向导rna的靶向序列互补，即紧靠基因组靶位点的正义(+)链的下游(3')(相对于向导rna的靶向序列)。参见例如wu,x.等人,“target specificity of the crispr
‑
cas9 system,”quant biol.2(2):59
‑
70(2014)，该文献的内容和公开内容以引用的方式并入本文。在正义(+)链上邻近靶位点(相对于向导rna的靶向序列)的基因组pam序列可以包含5'
‑
ngg
‑3’
。然而，向导rna的对应序列(即，紧靠向导rna的靶向序列的下游(3’))通常可以与基因组pam序列互补。向导rna通常可以是不编码蛋白质的非编码rna分子。向导rna的向导序列的长度可为至少10个核苷酸，诸如长度为12
‑
40个核苷酸、12
‑
30个核苷酸、12
‑
20个核苷酸、12
‑
35个核苷酸、12
‑
30个核苷酸、15
‑
30个核苷酸、17
‑
30个核苷酸、或17
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25个核苷酸，或长度为约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个核苷酸。向导序列至少可以是95％,至少96％,至少97％,与至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19至少99％或100％相同或互补基因组靶位点的dna序列的至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25或更多个连续核苷酸。
54.除向导序列之外，向导rna还可包含一个或多个其他结构或支架序列，所述一个或多个其他结构或支架序列可与rna指导的核酸内切酶结合或相互作用。此类支架或结构序列还可与其他rna分子(例如，tracrrna)相互作用。用于设计靶向构建体和向导rna以使用rna指导的核酸内切酶在植物基因组内的靶位点进行基因组编辑和定点整合的方法和技术是本领域已知的。
55.几种位点特异性核酸酶(例如重组酶，锌指核酸酶(zfn)，大范围核酸酶和talen)不是rna指导的，而是依靠它们的蛋白质结构来确定其引起dsb或缺口的靶标位，或者与dna结合蛋白结构域或基序融合、拴系或连接。位点特异性核酸酶(或融合/连接/拴系的dna结合结构域)的蛋白结构可使位点特异性核酸酶靶向靶位点。根据多个这些实施方案，可以根
据已知方法设计、改造和构建非rna指导的位点特异性核酸酶，例如重组酶、锌指核酸酶(zfn)、大范围核酸酶和talen，以靶标并结合至在植物的内源基因的基因组基因座处或附近的靶位点，以在这种基因组基因座处产生dsb或切口，从而通过修复dsb或切口来敲除或敲低该基因的表达，这可能导致产生通过细胞修复机制在供体模板分子的指导下进行突变或在dsb或切口部位插入序列。
56.在一个方面，本文所述的靶向基因组编辑技术可以包括重组酶的使用。在一些实施方案中，附着至dna识别结构域或基序的酪氨酸重组酶等可以选自由以下组成的组：cre重组酶、flp重组酶和tnp1重组酶。在一个方面，本文提供的cre重组酶或gin重组酶可以被栓系至锌指dna结合结构域。flp
‑
frt定点重组系统可以来自面包酵母即酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的2μ质粒。在该系统中，flp重组酶(翻转酶)可以重组在翻转酶识别靶标(frt)位点之间的序列。frt位点包含34个核苷酸。flp可以结合至frt位点的“臂”(一个臂处于反向)，并且在插入的核酸序列的任一末端切割frt位点。在切割后，flp可以重组在两个frt位点之间的核酸序列。cre
‑
lox是来源于噬菌体p1的定点重组系统，类似于flp
‑
frt重组系统。cre
‑
lox可以用于反转核酸序列、使核酸序列缺失或使核酸序列易位。在该系统中，cre重组酶可以重组一对lox核酸序列。lox位点包含34个核苷酸，前13个和最后13个核苷酸(臂)为回文。在重组过程中，cre重组酶蛋白结合至不同核酸上的两个lox位点，并且在lox位点进行切割。将切割的核酸剪接在一起(相互易位)，并且完成重组。在另一个方面，本文提供的lox位点是loxp、lox 2272、loxn、lox 511、lox 5171、lox71、lox66、m2、m3、m7或m11位点。
57.zfn为由与切割结构域(或切割半结构域)融合的工程改造的锌指dna结合结构域组成的合成蛋白，其可源自限制性核酸内切酶(例如，foki)。dna结合结构域可为典型的(c2h2)或非典型的(例如，c3h或c4)。根据靶位点，dna结合结构域可包含一个或多个锌指(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个锌指)。dna结合结构域中的多个锌指可通过一个或多个接头序列分开。zfn可被设计成通过锌指dna结合结构域的修饰来切割双链dna的几乎任何链段。zfn由包括与dna结合结构域融合的非特异性dna切割结构域(例如，来源于foki核酸酶)的单体形成二聚体，所述dna结合结构域包括被工程改造以结合靶位点dna序列的锌指阵列。zfn的dna结合结构域通常可由3至4个(或更多个)锌指组成。相对于促成与靶位点的位点特异性结合的锌指α
‑
螺旋的起点而言的
‑
1、+2、+3和+6位处的氨基酸可改变和定制以适应特定靶序列。其他氨基酸可形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的zfn。用于设计靶向和结合特定靶序列的zfn的方法和规则是本领域已知的。参见例如美国专利申请号2005/0064474、2009/0117617和2012/0142062，这些专利的内容和公开内容以引用的方式并入本文。foki核酸酶结构域可能需要二聚化来切割dna并且因此需要具有其c端区域的两个zfn来结合切割位点的相反dna链(相隔5
‑
7bp)。如果双zf结合位点是回文的，那么zfn单体可切割靶位点。如本文所用，zfn是广义的并且包括单体zfn，所述单体zfn可在没有另一个zfn帮助的情况下切割双链dna。术语zfn还可用于指被工程改造成共同作用以在同一位点处切割dna的一对zfn的一个或两个成员。
58.不受任何科学理论的束缚，因为可以使用多种方法之一重新设计锌指结构域的dna结合特异性，所以理论上可以构建定制的zfn，以靶向几乎任何靶标序列(例如，植物基因组中的基因处或附近)。用于工程改造锌指结构域的公开可获得的方法包括背景依赖组
装法(context
‑
dependent assembly；coda)、寡聚体库工程法(oligomerized pool engineering；open)和模块组装法。在一个方面，一种方法和/或本文提供的组合物包含一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个或五个或更多个zfn。在另一个方面，本文提供的zfn可以产生靶向dsb或切口。
59.通常在微生物中鉴定出的大范围核酸酶，诸如归巢核酸内切酶的laglidadg家族，为具有高活性和导致靶dna的位点特异性消化的长识别序列(＞14bp)的独特的酶。天然存在的大范围核酸酶的工程改造形式通常具有延长的dna识别序列(例如，14至40bp)。根据一些实施方案，大范围核酸酶可包含选自由i
‑
crei、i
‑
ceui、i
‑
msoi、i
‑
scei、i
‑
anii和i
‑
dmoi组成的组的支架或碱基酶。大范围核酸酶的工程改造可能比zfn和talen更具挑战性，因为大范围核酸酶的dna识别和切割功能交织在单个结构域中。已经使用专门的诱变和高通量筛选方法来产生识别独特序列并具有改良的核酸酶活性的新型大范围核酸酶变体。因此，大范围核酸酶可经选择或工程改造以结合植物中的基因组靶序列，诸如在基因的基因组基因座处或附近的靶序列。在另一个方面，本文提供的大范围核酸酶可以产生靶向dsb。
60.talen为通过将转录激活因子样效应物(tale)dna结合结构域与核酸酶结构域(例如，foki)融合而产生的人工限制性酶。当talen对的每个成员与靶位点侧翼的dna位点结合时，foki单体二聚化并在靶位点处造成双链dna断裂。除野生型foki切割结构域之外，已经设计了具有突变的foki切割结构域的变体以改良切割特异性和切割活性。foki结构域作为二聚体起作用，需要对于靶基因组中具有适当取向和间距的位点具有独特的dna结合结构域的两个构建体。talen dna结合结构域与foki切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单独talen结合位点之间的碱基数均是实现高活性水平的参数。
61.talen是通过将转录激活因子样效应物(tale)dna结合结构域与核酸酶结构域融合而产生的人工限制性酶。在一些方面中，核酸酶选自由以下组成的组：pvuii、muth、tevi、foki、alwi、mlyi、sbfi、sdai、stsi、cledorf、clo051和pept071。当talen对的每个成员与靶位点侧翼的dna位点结合时，foki单体二聚化并在靶位点处造成双链dna断裂。如本文所用，术语talen是广义的并且包括单体talen，所述单体talen可在没有另一个talen帮助的情况下切割双链dna。术语talen还指共同作用以在同一位点处切割dna的一对talen的一个或两个成员。
62.转录激活因子样效应物(tale)可被工程改造成实际上结合任何dna序列，诸如在植物中的基因的基因组基因座处或附近的序列。tale具有由13至28个具有33至34个氨基酸的重复单体组成的中心dna结合结构域。除12和13位的高变氨基酸残基之外，各单体的氨基酸都是高度保守的。两种可变氨基酸被称为重复序列可变双残基(rvd)。rvd的氨基酸对ni、ng、hd和nn分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且rvd的调节可识别连续的dna碱基。氨基酸序列与dna识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适当rvd的重复序列区段的组合来工程改造特定的dna结合结构域。
63.除野生型foki切割结构域之外，已经设计了具有突变的foki切割结构域的变体以改良切割特异性和切割活性。foki结构域作为二聚体起作用，需要对于靶基因组中具有适当取向和间距的位点具有独特的dna结合结构域的两个构建体。talen dna结合结构域与foki切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单独talen结合位点之间的碱基数均是实现高活性水平的参数。pvuii、muth和tevi切割结构域是用于与tale一起使用的foki和foki变体
的可用替代物。当与tale偶联时，pvuii作为高度特异性的切割结构域起作用(参见yank等人2013.plos one.8:e82539)。muth可以在dna中引入链特异性切口(参见gabsalilow等人2013.nucleic acids research.41:e83)。tevi在靶向位点处在dna中引入双链断裂(参见beurdeley等人,2013.nature communications.4:1762)。
64.氨基酸序列与tale结合结构域的dna识别之间的关系允许可设计的蛋白。诸如dna works的软件程序可用于设计tale构建体。设计tale构建体的其他方法是本领域技术人员已知的。参见doyle等人，nucleic acids research(2012)40：w117
‑
122。cermak等人，nucleic acids research(2011).39:e82和tale
‑
nt.cac.cornell.edu/about。在另一个方面，本文提供的talen可以产生靶向dsb。
65.根据一些实施方案，供体模板也可以存在于周围培养基等中，并且被引入、转移或递送(即，转移)至受体细胞，以作为由位点特异性核酸酶在受体细胞基因组中引入双链断裂(dsb)或切口后产生的所期望的编辑的模板。或者，供体模板可以存在于受体细胞中或由受体细胞表达。类似地，对于rna指导的核酸酶，表达向导rna(grna)的可转录的dna序列或转基因也可以存在于周围培养基等中，并且被引入、转移或递送(即，转移)至受体细胞中，以作为rna指导的核酸酶的向导rna，从而引导rna指导的核酸酶在受体细胞基因组中的所期望的基因座或靶位点处形成双链断裂(dsb)或切口。或者，向导rna(grna)可以存在于受体细胞中或由受体细胞表达。根据另外的实施方案，(i)位点特异性核酸酶、向导rna和供体模板可以全部存在于周围培养基等中，并且被引入、转移或递送至受体细胞，或者(ii)位点特异性核酸酶和/或向导rna可以存在于周围培养基等中，并且被引入、转移或递送至受体细胞，并且供体模板可以任选地存在于受体细胞中或由受体细胞表达，或者(iii)位点特异性核酸酶和/或供体模板可以存在于周围培养基等中，并且被引入、转移或递送至受体细胞，并且向导rna可以任选地存在于受体细胞或由受体细胞表达，或者(iv)向导rna和/或供体模板可以存在于周围培养基等中，并且被引入、转移或递送至受体细胞中，并且位点特异性核酸酶可以存在于受体细胞中或由受体细胞表达，在(i)、(ii)、(iii)或(iv)的每种情况下，在受体细胞基因组中所期望的基因座或靶位点处形成双链断裂(dsb)或切口，以在受体细胞的基因组中所期望的位置处产生模板化或非模板化的编辑或突变。
66.可潜在地选择植物基因组内的任何位点或基因座，以用于进行转基因、构建体或可转录dna序列的基因组编辑(或基因编辑)或定点整合。为了进行基因组编辑和定点整合，可以先在特定的基因组位点上使用位点特异性核酸酶(例如锌指核酸酶(zfn))形成双链断裂(dsb)或切口、工程或天然的大范围核酸酶、tale核酸内切酶或rna指导的核酸内切酶(例如，cas9或cpf1)。可使用本领域已知用于定点整合的任何方法。在存在具有插入序列的供体模板分子的情况下，可通过供体模板的一个或多个同源臂与植物基因组之间的同源重组，或通过非同源末端连接(non
‑
homologous end joining；nhej)修复dsb或切口，导致插入序列向植物基因组中的定点整合，以在dsb或切口位点处产生靶向插入事件。因此，如果转基因、可转录dna序列、构建体或序列位于供体模板的插入序列中，则可实现转基因、可转录dna序列、构建体或序列的位点特异性插入或整合。
67.dsb或切口的引入也可用于在植物基因组中引入靶向突变。根据此方法，可经由dsb或切口的不完全修复在靶位点处引入诸如缺失、插入、倒位(inversion)和/或取代的突变，以产生基因的敲除或敲减。即使在不使用供体模板分子的情况下，也可通过靶向基因座
的不完美修复来产生此类突变。基因的“敲除”可通过在基因的内源基因座处或附近诱导dsb或切口来实现，这导致蛋白的不表达或非功能蛋白的表达；而基因的“敲减”可通过在基因的内源基因座处或附近诱导dsb或切口而以类似方式实现，所述dsb或切口在不影响基因的编码序列的位点处以将消除所编辑的蛋白的功能的方式不完全修复。例如，内源基因座内dsb或切口的位点可处于基因的上游或5'区(例如，启动子和/或增强子序列)，以影响或降低其表达水平。类似地，基因的此类靶向敲除或敲减突变可用供体模板分子产生，以经由dsb或切口的修复在靶位点处或附近引导特定或期望的突变。相对于dsb或切口位点处或附近的靶向基因组序列，供体模板分子可包含同源序列，所述同源序列具有或不具有插入序列且包含一个或多个突变，诸如一个或多个缺失、插入、倒位和/或取代。例如，可以通过缺失或反转基因的至少一部分或者通过将移码或过早终止密码子引入基因的编码序列中来实现基因的靶向敲除突变。基因的一部分的缺失还可通过在两个靶位点处产生dsb或切口并造成侧接靶位点的居间靶区域的缺失来引入。
68.如本文所用，可以是重组多核苷酸、dna或rna供体模板的“供体分子”、“供体模板”或“供体模板分子”(统称为“供体模板”)被定义为以下核酸分子，所述核酸分子具有用于定点、靶向插入或重组到植物细胞的基因组中、通过修复植物细胞的基因组中的切口或双链dna断裂的核酸模板或插入序列。例如，“供体模板”可用于转基因或抑制构建体的定点整合，或用作将突变诸如插入、缺失、取代等引入植物基因组内的靶位点中的模板。本文所提供的靶向基因组编辑技术可包括使用一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个供体分子或模板。“供体模板”可为单链或双链dna或rna分子或质粒。供体模板的“插入序列”为设计用于靶向插入植物细胞基因组的序列，其可具有任何合适的长度。例如，供体模板的插入序列的长度可为2与50,000个之间、2与10,000个之间、2与5000个之间、2与1000个之间、2与500个之间、2与250个之间、2与100个之间、2与50个之间、2与30个之间、15与50个之间、15与100个之间、15与500个之间、15与1000个之间、15与5000个之间、18与30个之间、18与26个之间、20与26个之间、20与50个之间、20与100个之间、20与250个之间、20与500个之间、20与1000个之间、20与5000个之间、20与10000个之间、50与250个之间、50与500个之间、50与1000个之间、50与5000个之间、50与10000个之间、100与250个之间、100与500个之间、100与1000个之间、100与5000个之间、100与10,000个之间、250与500个之间、250与1000个之间、250与5000个之间、或250与10,000个之间的核苷酸或碱基对。供体模板还可具有至少一个同源序列或同源臂，诸如两个同源臂，以经由同源重组将突变或插入序列整合到植物基因组内的靶位点中，其中同源序列或所述一个或多个同源臂与植物基因组内靶位点处或附近的序列相同或互补或具有一定的百分比同一性或百分比互补性。当供体模板包含一个或多个同源臂以及插入序列时，所述一个或多个同源臂将侧接供体模板的插入序列或在其周围。
69.供体模板的插入序列可包含一个或多个基因或序列，所述一个或多个基因或序列各自编码转录的非编码rna或mrna序列和/或翻译的蛋白序列。供体模板的转录序列或基因可编码蛋白或非编码rna分子。供体模板的插入序列可包含不包含功能基因或完整基因序列的多核苷酸序列(例如，供体模板可仅包含调节序列，例如启动子序列，或仅包含基因的一部分或编码序列)，或者可能不包含任何可识别的基因表达元件或任何有效转录的基因序列。此外，供体模板可为线性或圆形的，并且可为单链或双链的。供体模板可以以从转基
因表达的rna分子的形式递送至细胞。供体模板也可以分别地作为裸核酸(例如，经由粒子轰击)、作为与一种或多种递送剂(例如，脂质体、蛋白质、泊洛沙姆、包裹有蛋白质的t链等)的复合物，或者包含在细菌或病毒递送媒介物(例如，根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)或双粒病毒组)中而递送至细胞。本文提供的供体模板的插入序列可以包含可转录的dna序列，所述可转录dna序列可以被转录为rna分子，所述rna分子可以是非编码的并且可以或可以不可操作地连接至启动子和/或其他调控序列。
70.根据一些实施方案，供体模板可不包含插入序列，而是包含一个或多个同源序列，所述一个或多个同源序列包括一个或多个突变，诸如相对于植物基因组内靶位点处(诸如植物基因组内的基因处或附近)的基因组序列的插入、缺失、取代等。或者，供体模板可包含有不包含编码或可转录dna序列的插入序列，其中插入序列用于将一种或多种突变引入植物基因组内的靶位点中，诸如植物基因组内的基因处或附近。
71.本文提供的供体模板可以包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个基因或可转录dna序列。或者，供体模板可以不包含基因。在不受限制的情况下，基因或供体模板的可转录dna序列可以包括例如杀虫抗性基因、除草剂耐受性基因、氮利用效率基因、水分利用效率基因、产量增加基因、营养品质基因、dna结合基因、可选择的标记基因、rnai或抑制构建体、位点特异性基因组修饰酶基因、crispr/cas9系统的单向导rna、基于双粒病毒组的表达盒或植物病毒表达载体系统。根据其他实施方案，供体模板的插入序列可包含蛋白编码序列或编码非编码rna分子的可转录dna序列，所述非编码rna分子可靶向用于抑制的内源基因。供体模板可以包含启动子，诸如组成型启动子、组织特异性或组织优选的启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。供体模板可以包含前导序列、增强子、启动子、转录起始位点、5'
‑
utr、一种或多种外显子、一种或多种内含子、转录终止位点、区域或序列、3'
‑
utr和/或多腺苷酸化信号。前导序列、增强子和/或启动子可以可操作地连接至编码非编码rna、向导rna、mrna和/或蛋白质的基因或可转录dna序列。
72.根据本发明的实施方案，重组供体模板多核苷酸分子的一部分(例如，插入序列)可以插入或整合进植物基因组内所期望的位点或基因座处。供体模板的插入序列可包含转基因或构建体，诸如编码非编码rna分子的转基因或可转录dna序列，所述非编码rna分子靶向用于抑制的内源性基因。供体模板还可具有侧接插入序列的一个或两个同源臂，以通过同源重组和/或同源定向修复促进靶向插入事件。每个同源臂可与植物基因组内的靶dna序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。因此，植物细胞可以包含编码供体模板的重组dna分子，所述供体模板用于转基因或构建体(诸如编码靶向用于抑制的内源性基因的非编码rna分子的转基因或可转录dna序列)至植物的基因组的的定点或定向整合。
73.如本文所用，用于基因组编辑或定点整合的“靶位点”是指植物基因组内的多核苷酸序列的位置，所述位置被位点特异性核酸酶结合和切割，所述位点特异性核酸酶将双链断裂(或单链缺口)引入多核苷酸序列和/或其互补dna链的核酸骨架中。靶位点可包含至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、
至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少29个或至少30个连续核苷酸。rna指导的核酸酶的“靶位点”可包含在靶位点处的双链核酸(dna)分子或染色体的任一互补链的序列。位点特异性核酸酶可以例如通过非编码向导rna(例如但不限于，如下文进一步描述的crispr rna(crrna)或单向导rna(sgrna))结合至靶位点。本文提供的非编码向导rna可以与靶位点互补(例如，与双链核酸分子的链或靶位点的染色体互补)。应当理解，非编码向导rna结合或杂交至靶位点可能不需要完美的同一性或互补性。例如，靶位点和非编码rna之间的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个错配(或更多个)可以是容许的。“靶位点”还指植物基因组内的多核苷酸序列的位置，所述位置被另一种位点特异性核酸酶结合和切割，所述另一种位点特异性核酸酶可以在不受非编码rna分子(诸如大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)或编码转录激活因子样效应子核酸酶(talen))的指导的情况下，将双链断裂(或单链缺口)引入多核苷酸序列和/或其互补dna链中。
74.如本文所用，“靶区域”或“靶向区域”是指侧接两个或更多个靶位点的多核苷酸序列或区域。在不受限制的情况下，在一些实施方案中，靶区区域可以经历突变、缺失、插入或倒位。如本文所用，“侧接”当用于描述多核苷酸序列或分子的靶标区域时，是指多核苷酸序列或分子的两个或更多个靶位点围绕靶标区域，在靶标区域的每一侧上具有一个靶位点。
75.实施例
76.包括以下实施例以展示本公开的某些实施方案。本领域的技术人员应当理解，以下这些实施例表示可以在本发明的方法和实施方案的实践中使用的技术和方法。然而，根据本公开，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对本文公开的具体实施方案进行很多修改、改变和替换以获得类似的结果。
77.实施例1：将tat
‑
cre蛋白递送至受伤的玉米愈伤组织细胞中。
78.产生了在核基因组中具有重组dna构建体的转基因玉米品系a，所述重组dna构建体在5'至3'方向上包括增强型camv 35s启动子和5'非翻译区中的hsp70内含子、侧接有两个lox位点的nptii可选择的标记基因盒，然后是绿色荧光蛋白(gfp)编码基因(参见例如zhang等人,theor.appl.gen.107(7):1157
‑
1168；2003)。在这种排列中，由于在35s启动子和gfp编码序列之间插入了nptii基因，gfp不能在功能上表达。然而，在cre重组酶的存在下，由于侧接lox位点而切除nptii基因，这导致可以通过将35s启动子和gfp编码序列放置在一起来在大多数组织中观察到的高水平的gfp表达(图1)。因此，插入玉米品系a的基因组中的gfp构建体可以用作cre重组酶在转基因玉米品系的一种或多种细胞中存在和活性的报告基因。使用本领域已知的方法从转基因玉米品系a的未成熟胚产生胚性愈伤组织细胞(参见例如，sidorov和duncan,methods in molecular biology,第526卷,transgenic maize.methods and protocols,humana press(2009))。将约1.5克来自转基因玉米品系a的愈伤组织细胞切成小块，包装成团块，并且在培养基1074上生长。表1显示了培养基1074的组成。
79.表1.培养基1074的组成
80.成分成分描述量ms_basal_saltms基础盐2.165gmp00266ms维生素(100x)5.000ml
sucrose蔗糖20.000gtc_water_to_volume用tc水定容至1000.000mlph_with_koh_to用koh将ph调整至5.800gelzan_cmgelzan cm3.000gautoclave高压灭菌 mp00255iba(1mg/ml)0.750mlmp00161naa(1mg/ml)0.500ml
81.购自millipore的tat
‑
cre重组酶是一种重组细胞渗透性融合蛋白，由来源于hiv
‑
tat的碱性蛋白质易位肽(tat)、核定位序列(nls)、cre蛋白和n
‑
末端组氨酸标签(h6)组成，所述n
‑
末端组氨酸标签用于从大肠杆菌(e.coli)有效地纯化蛋白质(http：//www.emdmillipore.com/us/en/product/tat
‑
cre
‑
recombinase，mmnf
‑
scr508)。在200μl pbs缓冲液中制备tat
‑
cre蛋白溶液，tat
‑
cre蛋白的浓度为15.6μg或31.2μg。为了测试将tat
‑
cre重组酶蛋白转移和递送至愈伤组织细胞的能力，使用来自具有gfp报告基因构建体的玉米品系a的愈伤组织细胞进行若干实验。在每次处理中，使用如上文所述制备的2
‑
3ml包装的愈伤组织细胞(在切碎后)，无需清洗，直接涂布在培养基1074上。在培养3周后，鉴定出第一gfp阳性愈伤组织块(图2a
‑
c)。分离出四个gfp阳性愈伤组织，并且将它们在相同培养基上进行继代培养。gfp阳性的愈伤组织品系中的三个是可再生的，并且还生长到出芽。还发现这些再生的植株在叶片中具有gfp表达(图2d和2e)。将植株转移至生根培养基1796(表2)，随后转移至温室中。
82.表2.培养基1796的组成
[0083][0084]
使用被设计为扩增gfp报告基因构建体的引物对从再生的gfp阳性和阴性植株的芽组织采集的样品进行pcr(图4a)。从自gfp阳性愈伤组织再生的植株1
‑
3采集的基因组dna样品在cre
‑
lox切除后产生具有预期大小的片段(参见图3；分别来自gfp阳性植株1
‑
3的芽样品具有切除的条带，而来自gfp阴性对照植株4的芽样品具有预期更长的未切除片段大小)。图3进一步显示了来自阳性对照样品的切除的条带以及切除的构建体。与来自gfp阴性对照植株4的雄花小穗中无gfp表达(图4c)相比，还在蓝光下观察到gfp阳性植株2的雄花小穗中的gfp表达(图4b)。
[0085]
使用本领域已知的ctab方法从叶组织中分离基因组dna。使用primestar gxl聚合酶(takara)和一组在gfp报告基因构建体上游和下游杂交的引物进行pcr反应，并且在1％琼脂糖凝胶中解析来自这些反应的pcr产物(图3)。与未切除的dna片段的～2.18kb条带相
比，通过切除的dna片段的～0.97kb条带的存在来确认nptii基因盒的cre切除。通过对预期的重组连接点测序也确认了nptii基因的切除。
[0086]
实施例2：将cre蛋白递送至受伤的玉米愈伤组织细胞中。
[0087]
如上文实施例1所述，从转基因玉米品系a的未成熟胚产生胚性愈伤组织细胞。将3
‑
4克愈伤组织在含有50％浓度的培养基4278(表3)和0.3m甘露醇的培养基中高速共混9
‑
10秒，以获得大小为1
‑
2mm的愈伤组织块的精细悬浮液。在共混后，将愈伤组织悬浮液倾入筛子中，用共混所用的培养基洗涤，然后吸到滤纸上。
[0088]
表3.培养基4278的组成
[0089]
成分成分描述量mp00927fn
·
iite大量储液(10x)100.000mlms_micron utrientms微量营养素100.000mlgamborgs_b5_500xgamborgs b5 500x2.000mlsucrose蔗糖30.000gasparagine_monohyd天冬酰胺一水合物1.000gtc_water_to_volume用tc水定容至1000.000mlph_with_koh_to用koh将ph调整至5.700filter_sterilize_022micron用0.22微米单元过滤灭菌 [0090]
重组cre蛋白使用公知方法来制备(j mol biol.；313(1)：49
‑
69；2001)。将重组cre蛋白置于浓度为4.8mg/ml的25mm tris，ph8.0和300mm nacl的缓冲液中，并且通过0.2微米过滤器过滤以灭菌。将1ml该重组cre溶液添加至3ml共混的愈伤组织悬浮液中。在该实验中进行两次处理。在一次处理中，将重组cre蛋白溶液添加至共混的愈伤组织悬浮液中，并且用1ml peg溶液处理(表4)。
[0091]
表4.peg溶液的组成
[0092] 储液对于10mlpeg 40000(mallinckrodt baker，inc.)n/a4.0g水n/a2.0ml甘露醇0.8m3.0mlca(no3)2·
x 4h2o1m1.0ml
[0093]
将愈伤组织与蛋白质/peg小心混合，在平板上放置10分钟，并且缓慢添加w5培养基(表5)，然后除去绝大部分以洗脱cre/peg溶液。
[0094]
表5.w5溶液的组成
[0095][0096]
[0097]
将细胞团块重悬于少量新鲜的w5培养基中，并且转移至含有培养基1074的平板中。将细胞团块均匀地涂布于平板上，并且用精细移液器除去液体。将平板置于percival容器中在28℃下孵育。在第二次处理中，将重组cre蛋白溶液直接添加至共混的愈伤组织悬浮液中(即，不含peg)。在两次处理中，将含有培养基1074的细胞平板培养至少三天，然后分析gfp表达。在这些实验中，仅在三天培养后(图5a和b)和在六天培养后(图5c)，在含有用peg处理的共混愈伤组织悬浮液的平板中观察到gfp表达。在未用peg处理的具有cre的愈伤组织的平板中未发现gfp表达。
[0098]
实施例3：将rnp递送至受伤的玉米愈伤组织细胞中。
[0099]
将cre重组酶递送至受伤的愈伤组织细胞的能力表明，其他蛋白质、核糖核蛋白和核酸酶也可以通过这种方法添加至细胞中。如上文实施例1所述，从玉米未成熟胚产生胚性愈伤组织细胞，并且如上文实施例2所述，产生受伤的愈伤组织悬浮液。如上所述，将共混的愈伤组织悬浮液洗涤和干燥。当下文所述的rnp复合物溶液与受伤的愈伤组织细胞混合时，可以如上文所述添加peg溶液。
[0100]
为了产生向导rna
‑
cas9核糖核蛋白(rnp)复合物，将20.6μg cas9蛋白和8.6μg grna在1
×
neb缓冲液3(100mm nacl、50mm tris
‑
hcl、10mm mgcl2、1mm dtt，ph7.9，在25℃下)中混合，得到1:2的cas9与grna摩尔比，添加1μl rna酶抑制剂(ribolock；thermo fisher scientific)达到30μl的总体积，并且在室温下孵育至少1.5min。任选地对于共递送，将aada pcr产物添加至预混物中。为了产生向导rna
‑
cpf1 rnp复合物，将浓度为6.6mg/ml(44.7um)的cpf1蛋白与grna混合，以产生1:5的cpf1与grna摩尔比。
[0101]
将受伤的愈伤组织细胞与rnp复合物溶液一起孵育预定时间期。在孵育后，将愈伤组织悬浮液铺板于培养基1074上并且如上文所述培养以产生植株。然后将植株转移到生根培养基1796中，随后转移至温室中。收获植株的一部分用于分子和表型分析，以确认所递送的rnp对基因或基因组的编辑。
[0102]
虽然已经参考某些实施方案公开了本发明，但是将显而易见的是，在不脱离如本文所述以及如所附权利要求所提供的本发明的精神和范围的情况下，修改和变化是可能的。此外，应当理解，虽然示出了本发明的实施方案，但是本公开中的所有实施例都作为非限制性实施例来提供，并且因此，不应将其视为对如此示出的各个方面的限制。本发明旨在具有由本公开、以下权利要求的语言及其任何等同形式所定义的全部范围。因此，实施例、附图和具体实施方式应视为说明性且非限制性的。