一种液基细胞保存处理液及其制备方法和应用与流程

本申请涉及细胞保存液，具体涉及一种液基细胞保存处理液及其制备方法和应用。
背景技术：
：宫颈癌是目前女性癌症中最常见的恶性肿瘤之一。早期诊断宫颈癌及癌前病变是提高宫颈癌治愈率及患者生存率的关键，细胞学检查是目前临床应用最广泛的筛查子宫颈癌的主要方法。液基细胞学检查是上世纪90年代末发明的一项细胞学新技术，对宫颈癌及癌前病变诊断准确性较高，被认为是宫颈癌早期诊断、早期预防的最佳方法。液基细胞学检查是上世纪90年代末发明的一项细胞学新技术，对宫颈癌及癌前病变诊断准确性较高，被认为是宫颈癌早期诊断、早期预防的最佳方法。液基薄层细胞学检测技术中最为关键的试剂是细胞保存液。在分析从生物体采集的细胞时，由于从生物体分离后，细胞就开始自身分解，在从细胞的采集至分析之间、有必要将细胞适合地保存。具有固有细胞形态和结构的活细胞标本对临床医学诊断等很多方面具有应用价值，一旦细胞脱离原来的生存环境，细胞的形态结构都将会发生改变，只有通过正确的细胞保存方法才能确保得到正确的诊断。液基细胞保存液是液基薄层细胞学检测技术主要耗材，克服了传统巴氏涂片的毛病，采集到的细胞几乎全部保存到保存液里，涂片细胞重叠少、无退变或退变轻微，背景干净清晰，液基细胞学检查的敏感性和特异性均优于传统巴氏涂片。目前，美国新柏氏生产的保存液临床价格昂贵，国内液基细胞保存液常用醇类作为固定保鲜剂，如甲醇、乙醇、异丙醇，其中甲醇和异丙醇属于有毒有害成分，不利于操作人员的健康，且以甲醇为固定保鲜剂，还会造成细胞成团结块，蛋白质粘液也易结块沉积，不利于细胞的分散和观察。而乙醇含量高时可以固定流动性高的蛋白质，但随即会形成沉积物，不能很好的转移到载玻片，同时会导致细胞表面变形和细胞退化，这给细胞学检查带来困扰。乙醇浓度较低时细胞不能长时间固定保存，液基细胞保存液不可以维持细胞原有的形态结构和生理功能，大大降低了检测结果的准确性。技术实现要素：为改善醇类细胞保存液易形成沉积物、导致细胞表面变形和细胞退化的缺陷，本申请提供一种液基细胞保存处理液及其制备方法和应用。第一方面，本申请提供一种液基细胞保存处理液，采用如下技术方案实现：一种液基细胞保存处理液，按质量百分比计，其包括如下原料：所述peg选自peg-200、peg-400、peg-600中的一种或多种。通过采取上述技术方案，采用乙醇为固定脱水剂，乙醇的含量为18-28wt％，不易造成细胞成团结块，蛋白质粘液也不易结块沉积，利于细胞的分散和观察。且乙醇和peg的组合解决了单乙醇的固定效果，用量也少，降低了成本，也克服了甲醇的问题，同时毒性更低，也抑制乙醇的挥发，细胞的变形小，增长了细胞的保存时间。peg作为固定加强剂，其分子量的大小影响液基细胞保存液的效果，分子量高于600的peg偏向胶状，不利于生产，且分子量越大，固定和渗透力都减弱，会增大体系粘度，造成细胞成团结块，蛋白质粘液结块沉积，不利于细胞的分散和观察。脂肪醇聚氧乙烯醚和peg共同作用，可以增加体系的增溶性和分散性，提高了粘液软化打散效果，有效降低了细胞被消化、破坏的难度，使细胞的变形小，增长了细胞的保存时间。优选的，按质量百分比计，所述液基细胞保存处理液包括如下原料：通过采取上述技术方案，本申请通过调控液基细胞保存处理液各原料的组分，有效避免了蛋白质形成沉积物，减少细胞表面变形和细胞退化，进一步提高了保存时间，同时还提高了溶血效果，细胞核结构清晰、无背景着色。优选的，所述脂肪醇聚氧乙烯醚的hlb值为13-14。通过采用上述技术方案，本申请hlb值为13-14的脂肪醇聚氧乙烯醚，水溶性好，对粘液软化打散效果好，且可以增强细胞膜的通透性，溶血效果好，有效减少了细胞变形性，提高了细胞的保存时间，即使保存112天后也很少有细胞变形。优选的，所述脂肪醇聚氧乙烯醚、peg-400的质量比1：(61.5-72.7)；更优选的，所述脂肪醇聚氧乙烯醚、peg-400的质量比1：66.7。通过采用上述技术方案，本申请调节脂肪醇聚氧乙烯醚、peg-400的质量比为1：(61.5-72.7)，尤其是其质量比为1：66.7时，不仅可以降低细胞保存处理液的表面活性，还能促进对粘液的增溶和细胞的分散，优化对粘液软化打散效果，使细胞不易被消化、破坏，提高细胞的保存时间。优选的，按质量百分比计，所述液基细胞保存处理液还包括尿素0.1-2％、koh1-3％；更优选的，按质量百分比计，所述液基细胞保存处理液还包括尿素0.8-1.3％、koh1.5-2.5％；最优选的，按质量百分比计，所述液基细胞保存处理液还包括尿素1.1％、koh2％。通过采用上述技术方案，向细胞保存处理液中加入不同含量的尿素和koh，尿素含量会影响细胞保存处理液的溶血效果，koh含量的高低不仅影响磷酸缓冲液的缓冲能力，也会影响体系的分散性和peg的细胞渗透力，尤其是112天后的细胞变形性。优选的，所述尿素、脂肪醇聚氧乙烯醚的质量比为(16-17)：1。通过采用上述技术方案，本申请采用尿素和脂肪醇聚氧乙烯醚复配作为溶血剂，且控制两者比例为(16-17)：1，不仅优化了溶血效果，显微镜下观察涂片无溶血不良残渣背景，又减少了细胞的变形性，最重要的是提高了细胞的保存时间，使细胞在细胞保存处理液中放置56天后无细胞变形。优选的，所述抗凝剂由螯合剂和溴己新按质量比为(10-20)：1混合而成；更优选的，所述抗凝剂由螯合剂和溴己新按质量比为16.7：1混合而成。通过采用上述技术方案，本申请采用溴己新和螯合剂复配，在aeo-9和peg400的作用下，不仅可以降低溴己新的用量，还可以提高细胞保存处理液的固化效果和粘液软化打散效果，进而提高细胞的保存时间。优选的，所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钾或乙二胺四乙酸；更优选的，所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钾。通过采用上述技术方案，本申请采用乙二胺四乙酸二钾与溴己新复配作为抗凝剂，进一步提高细胞保存处理液对细胞的渗透力，还可以提高粘液的分散性，便于观察细胞形态。第二方面，本申请提供一种液基细胞保存处理液的制备方法，采用如下的技术方案：一种液基细胞保存处理液的制备方法，包括如下步骤：按比例向超纯水中加入氯化钠、磷酸缓冲液、抗凝剂、脂肪醇聚氧乙烯醚和peg，溶解，再加入乙醇，搅拌均匀，得液基细胞保存处理液。第三方面，本申请提供一种液基细胞保存处理液的应用，采用如下的技术方案：一种液基细胞保存处理液的应用，所述液基细胞保存处理液应用于对体液样本中的细胞和微生物的保存。综上所述，本申请具有以下有益效果：1、本申请采用乙醇为固定脱水剂，乙醇的含量为18-28wt％，不易造成细胞成团结块，蛋白质粘液也不易结块沉积，利于细胞的分散和观察。且乙醇和peg的组合解决了单乙醇的固定效果，用量也少，降低了成本，也克服了甲醇的问题，同时毒性更低，也抑制乙醇的挥发，细胞的变形小，增长了细胞的保存时间。脂肪醇聚氧乙烯醚和peg共同作用，可以增加体系的增溶性和分散性，提高了粘液软化打散效果，有效降低了细胞被消化、破坏的难度，利于解决血细胞处理不到位、阳性细胞堆叠和细胞核缩小等缺陷，延长了细胞的保存时间，利于细胞的分散和观察，提高了检测的准确性。2、本申请采用hlb值为13-14的脂肪醇聚氧乙烯醚，水溶性好，对粘液软化打散效果好，且可以增强细胞膜的通透性，溶血效果好，有效减少了细胞变形性，提高了细胞的保存时间，即使保存112天后也很少有细胞变形。3、本申请采用尿素和脂肪醇聚氧乙烯醚复配作为溶血剂，且控制两者比例为(16-17)：1，不仅优化了溶血效果，又减少了细胞的变形性，使细胞在细胞保存处理液中放置56天后无变形。4、本申请采用溴己新和螯合剂复配，在aeo-9和peg400的作用下，不仅可以降低溴己新的用量，还可以提高细胞保存处理液的固化效果和粘液软化打散效果，进而提高细胞的保存时间。附图说明图1为宫颈脱落细胞染色后粘液消化良好且细胞无重叠堆积的细胞涂片在显微镜下的示意图。图2为宫颈脱落细胞染色后无细胞核缩小的细胞涂片在显微镜下的示意图。图3为宫颈脱落细胞染色后无细胞变形的细胞涂片在显微镜下的示意图。具体实施方式以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。本申请使用的原料均可通过市售获得，若无特殊说明，均购买自国药集团化学试剂有限公司。实施例实施例1-26提供了一种液基细胞保存处理液，以下以实施例1为例进行说明。实施例1提供的液基细胞保存处理液，其原料组成见表1，其制备步骤为：按表1中的质量百分比，向超纯水中加入氯化钠、磷酸缓冲液、乙二胺四乙酸二钠、aeo-7和peg-200，溶解，再加入无水乙醇，搅拌均匀，得液基细胞保存处理液；其中，所述超纯水是指电阻率达到18.3mω·m(25℃)的水，由型号为hdn-b689(购自泉州孚诺泰环保设备有限公司)的超纯水处理设备处理后的水；所述磷酸缓冲液为57.7ml1mol/lna2hpo4和42.3ml1mol/lnah2po4溶液配制而成；所述aeo-7购买自南通阿切斯化工有限公司；所述peg-200购买自江苏省海安石油化工厂。表1实施例2-5，同实施例1，不同之处仅在于：所述液基细胞保存处理液制备原料的质量百分比不同，具体见表1。实施例6，同实施例5，不同之处仅在于：所述peg-200替换为peg-400，所述peg-400购买自江苏省海安石油化工厂。实施例7，同实施例5，不同之处仅在于：所述peg-200替换为peg-600，所述peg-600购买自江苏省海安石油化工厂。实施例8，同实施例6，不同之处仅在于：所述aeo-7替换为aeo-9，所述aeo-9购买自南通阿切斯化工有限公司。实施例9，同实施例6，不同之处仅在于：所述aeo-7替换为aeo-15，所述aeo-15购买自南通阿切斯化工有限公司。实施例10-12，同实施例8，不同之处仅在于：所述aeo-9和peg-400的质量百分比不同，具体见表2。表2实施例实施例8实施例10实施例11实施例12aeo-9(wt％)0.060.0650.0550.06peg-400(wt％)4444.5实施例13-17，同实施例8，不同之处仅在于：所述尿素、koh的质量百分比不同，具体见表3。表3实施例实施例8实施例13实施例14实施例15实施例16实施例17尿素(wt％)00.120.81.31.1koh(wt％)0131.52.52实施例13-17提供的液基细胞保存处理液，以下以实施例13为例进行说明。实施例13提供的液基细胞保存处理液，其制备步骤为：按质量百分比计，向超纯水中加入氯化钠0.78wt％、磷酸缓冲液1.1wt％、koh1wt％、乙二胺四乙酸二钠0.5wt％、aeo-90.06wt％、尿素0.1wt％和peg-4004wt％，溶解，再加入无水乙醇23wt％，搅拌均匀，得液基细胞保存处理液。实施例14-17提供的液基细胞保存处理液的制备方法，同实施例13，不同之处仅在于：尿素、koh的质量百分比不同，如表3所示。实施例18，同实施例17，不同之处仅在于：所述尿素的质量百分比由1.1wt％替换为0.96wt％。实施例19，同实施例17，不同之处仅在于：所述尿素的质量百分比由1.1wt％替换为1.02wt％。实施例20，同实施例18，不同之处仅在于：所述乙二胺四乙酸二钠替换为乙二胺四乙酸二钾。实施例21，同实施例18，不同之处仅在于：所述乙二胺四乙酸二钠替换为乙二胺四乙酸。实施例22-25，同实施例20，不同之处仅在于：所述抗凝剂的组成不同，具体见表4。表4抗凝剂组成实施例20实施例22实施例23实施例24实施例25乙二胺四乙酸二钾(wt％)0.50.50.50.50.6溴己新(wt％)00.010.050.030.03其中，所述溴己新的cas号为3572-43-8。实施例26，同实施例24，不同之处仅在于：所述溴己新替换为盐酸溴己新，所述盐酸溴己新的cas号为611-75-6。对比例对比例1，同实施例2，不同之处仅在于：所述无水乙醇的含量由28wt％替换为30wt％。对比例2，同实施例1，不同之处仅在于：所述无水乙醇的含量由18wt％替换为15wt％。对比例3，同实施例1，不同之处仅在于：所述aeo-7替换为吐温t-20，所述吐温t-20购买自海安国云化工有限公司。对比例4，同实施例1，不同之处仅在于：所述aeo-7替换为tx-10，所述tx-10购买自江苏省海安石油化工厂。对比例5，同实施例1，不同之处仅在于：所述peg-200替换为peg-10000，所述peg-1000购买自江苏省海安石油化工厂。对比例6，同实施例1，不同之处仅在于：所述peg-200的含量由3wt％替换为0wt％。性能检测试验针对本申请实施例1-26和对比例1-6提供的液基细胞保存处理液，进行如下的性能检测。1、沉积物：准备320例2020年1-12月期间在深圳市多家医院检验科和体检科收集的宫颈分泌物样本，处理得宫颈脱落细胞标本，每个实施例和对比例各筛选10个宫颈脱落细胞标本，将宫颈脱落细胞标本置于实施例1-26和对比例1-6提供的液基细胞保存处理液中28天，观察无沉积物的标本数量，测试结果见表5。2、细胞染色后状态：准备320例2020年1-12月期间在深圳市多家医院检验科和体检科收集的宫颈分泌物样本，处理得宫颈脱落细胞标本，每个实施例和对比例各筛选10个宫颈脱落细胞标本，将宫颈脱落细胞标本置于实施例1-26和对比例1-6提供的液基细胞保存处理液中28天，后取出转移到载玻片上，制出320个细胞涂片，将细胞涂片用巴氏染色液(型号papanicolaouea36，购自上海如吉生物科技发展有限公司)进行染色，后在显微镜下观察粘液消化良好且细胞无重叠堆积(如图1所示效果)、无细胞核缩小(如图2所示效果)的涂片数量，测试结果见表5。3、保存时间：准备960例2020年1-12月期间在深圳市多家医院检验科和体检科收集的宫颈分泌物样本，分成三组，分别对应28天、56天、112天，每组320例，处理得宫颈脱落细胞标本，每个实施例和对比例各筛选10个宫颈脱落细胞标本，将宫颈脱落细胞标本置于实施例1-26和对比例1-6提供的液基细胞保存处理液中28、56、112天，后取出转移到载玻片上，每组制出320个细胞涂片，将细胞涂片用巴氏染色液(型号papanicolaouea36，购自上海如吉生物科技发展有限公司)进行染色，后在显微镜下观察无细胞变形(如图3所示效果)的涂片数量，测试结果见表5。表5以下结合表5提供的检测数据，详细说明本申请。从本申请实施例1和对比例2可知，乙醇含量低于18wt％时，固定效果差，细胞形态完整性大大降低，其余性能也有所降低，也易导致细胞表面变形和细胞退化，降低保存时间。从本申请实施例2和对比例1可知，乙醇含量高于28wt％时，固定效果较好，可以固定流动性高的蛋白质，但存在蛋白质形成沉积物，不能很好的转移到载玻片，易导致细胞表面变形和细胞退化，保存时间较短。从本申请实施例1和对比例6可知，peg可以作为固定加强剂，增加细胞渗透力，乙醇和peg的组合解决了低用量乙醇固定效果差的问题，且peg的加入可以提高体系的分散性，使细胞不易被消化和破坏，提高了细胞的保存时间。从本申请实施例1和对比例5可知，peg的分子量对液基细胞保存液的影响较大，不仅固定和渗透力减弱，且peg-10000的粘度过高，粘液软化打散效果差，反而会引起蛋白质形成沉积物，使细胞易被消化、破坏，使细胞的变形大，减短了细胞的保存时间。从本申请实施例1和对比例3-4可知，在peg作用下，脂肪醇聚氧乙烯醚比聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、壬基酚聚氧乙烯醚的增溶性和分散性更好，粘液软化打散效果好，有效降低了细胞不被消化、破坏，使细胞的变形小，增加了细胞的保存时间。从本申请实施例1-5可知，通过调控液基细胞保存处理液各原料的组分，有效避免了蛋白质形成沉积物，减少细胞表面变形和细胞退化，进一步提高了细胞的保存时间，同时还提高了溶血效果，使细胞核结构清晰、无背景着色，其中，实施例5相对较优。从本申请实施例5-7可知，peg-200、peg-400、peg-600均具有固定加强剂增加细胞渗透力的作用，其中，peg-400亲水性和粘度更适合抑制乙醇的挥发，对细胞的固定效果更好，可以延长细胞的保存时间，56天或112天细胞变形少、退化少。从本申请实施例6、8-9可知，aeo-9与aeo-15和aeo-7相比，aeo-9的环氧乙烷的加成数为9，aeo-9的水溶性比aeo-7的水溶性好，对粘液软化打散效果好；aeo-9的hlb值为13-14，aeo-9对细胞膜的通透性增强作用强于aeo-15，且hlb值为15-16的aeo-15溶血效果较差，aeo-9有效减少了细胞变形性，提高了细胞的保存时间，即使保存112天后也很少有细胞变形。从本申请实施例8、10-12可知，aeo-9和peg-400的质量比对体系的分散性和增容性影响较大，实施例8、10、11、12中aeo-9和peg-400的质量比分别为1：66.7、1：61.53、1：72.73、1：75，结合实施例8、10-12的实验数据可知，实施例8对细胞的保存效果较优。实施例8对应的无沉积物数为10、粘液消化良好且细胞无重叠堆积数为10、无细胞核缩小为10，且在实施例8提供的细胞保存处理液中保存56天后还能实现10个无细胞变形。从本申请实施例8、13-17可知，不同含量的尿素和koh对体系对细胞的保存时间的影响较大，其中，尿素含量为1.1wt％和koh含量为2wt％的效果较优。从本申请实施例17-19可知，本申请采用尿素和脂肪醇聚氧乙烯醚复配作为溶血剂，且控制两者比例为(16-17)：1，不仅优化了溶血效果，显微镜下观察涂片无溶血不良残渣背景，又减少了细胞的变形性，最重要的是提高了细胞的保存时间，在细胞保存处理液中放置56天后无细胞变形数为10。在实际应用中，除了宫颈分泌物脱落细胞，本申请液基细胞保存处理液还可以用于对体液、体腔、体表等脱落细胞进行染色，辅助临床病理学诊断，助力临床医学的发展和进步。本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。当前第1页12