基于基因组杂合度的杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本选择方法和子叶败育杂种胚挽救方法与流程

1.本发明涉及杏属植物远缘杂交技术领域。具体地说是基于基因组杂合度的杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本选择方法和子叶败育杂种胚挽救方法。


背景技术：

2.杏是我国栽培历史悠久的传统果树，亦是发展潜力巨大的木本粮油经济树种。杏属不同种、品种群具有独特的优良性状：普通杏果实大，果肉酸甜可口；仁用杏和西伯利亚杏种仁饱满、脂肪酸和蛋白质含量高，种仁品质优良；新疆杏果实香甜，种仁饱满，果仁兼优，花期晚不易受倒春寒影响。不同种、品种群之间的杂交有利于杏优良果、仁性状的聚合，是新品种创制的有效途径。
3.杏不同种、品种群之间存在生殖隔离以及普遍的杂交不亲和现象，杂交很难获得种子或种子无法萌发，经过多年杂交授粉试验发现，杏不同种、品种群间的平均结实率为0.71％，其中52.67％为子叶败育的干瘪种子，有效杂交种子结实率仅为0.38％；因此，高亲和骨干亲本的选择对杏的高效育种具有重要意义。目前常使用重复授粉、混合花粉授粉、提前或延迟授粉、生理活性物质或射线处理等方法来克服种间杂交不亲和，然而传统方法获得的杂种结实率低，且存在严重胚败育的现象，难获得有效种子。
4.种间、品种群间杂种胚通常在盛花后50天左右发育完成，但胚乳转化子叶阶段容易出现败育落果现象，极少数败育杂交果即使发育成熟，种子也干瘪失去活力，导致有效杂交种子数量极少。子叶败育胚挽救技术能够及时将成熟杂交胚进行离体培养，获得扩繁植株，有效提高杏属植物种间、品种群间的杂交效率，为杏优特异品种创制提供技术支撑。


技术实现要素：

5.为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于基因组杂合度的杏属植物种、品种群间的高亲和骨干亲本选择方法，能够有效提高杏属植物远缘杂交亲和性，同时还提供一种子叶败育杂种胚的挽救方法，以解决杂种胚发育过程中的败育问题，极大提高杏属植物种间以及品种群间远缘杂交效率，服务杏属植物优特异新品种创制。
6.为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
7.基于基因组杂合度的杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本选择方法，从杏属植物中选取性状优良的目标品种；计算目标品种的基因组杂合度；从目标品种中筛选出基因组杂合度大于或等于1％的杏属植物亲本即为杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本。一般二倍体植物的基因组杂合度在0.5％～1.2％之间，杏的高杂合基因组的杂合度在1％以上，通过选用高杂合度品种进行杏种、品种群间杂交授粉，能够有效提高杏属植物远缘杂交亲和性。
8.上述基于基因组杂合度的杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本选择方法，目标品种的基因组杂合度的计算方法为：
9.(1)选取目标品种幼嫩叶片进行dna提取；本发明中dna的提取方法为常规方法，比
如ctab法等；
10.(2)对提取得到的dna进行高通量测序(high throughput sequencing,hts)，获得核苷酸序列数据经过质量控制后，得到序列文件；质量控制的目的是过滤掉低质量序列，质量控质的方法主要包括去掉reads的接头序列；截掉reads两端测序不准确的碱基；直接截取左端5个碱基，右端5个碱基；去除当中还含有n的reads；当一条reads中超过20％的碱基质量分数小于20，则舍弃该reads所对应的一对reads；
11.(3)利用kmc软件对序列文件进行k-mer的计数和统计，然后利用genome scope软件通过二项式模型(negative binomial model)对k-mer数据进行拟合分析，计算得到基因组杂合度。
12.上述基于基因组杂合度的杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本选择方法，目标品种包括
‘
树上干’杏、
‘
小白杏’、
‘
珍珠油杏’、
‘
金太阳’杏、
‘
中仁5号’杏、西伯利亚杏
‘
f106’【西伯利亚杏
‘
f106’参见chen,c.,liu,h.,gou,n.et al.aprgpd:the apricot genomic and phenotypic database.plant methods 17,98(2021).】、
‘
优一’杏和
‘
龙王帽’杏。
13.子叶败育杂种胚的挽救方法，包括如下步骤：
14.步骤a：在杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本授粉后，采集杂交果，并取出杂交果的种仁；杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本为利用上述基于基因组杂合度的杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本选择方法筛选得到的；
15.步骤b：将杂交果的种仁进行消毒处理后，用镊子、手术刀去除种仁的种皮后，剥开子叶取出杂种胚放入初代培养基中培养；
16.步骤c：在杂种胚的上胚轴与下胚轴交界处横切后得到的两部分分别进行放入继代培养基中培养，得到扩繁植株；杂种胚分离后进行初代培养成活率较高(92.6％)，而整个种子或剥开子叶培养成活率低(仅为9.1％和26.1％)。杂种胚初代培养后，小苗必须沿上胚轴与下胚轴交界处横切分为两部分，分别进行下一步继代培养才能正常分化和增殖，不横切、横切位置不对或其他切的方式均无法增殖分化，不能达到扩繁目的。
17.步骤d：将扩繁植株分离并放置于壮苗培养基中培养，获得健壮杂种苗；
18.步骤e：取健壮杂交苗上的健壮枝条嫁接到杏树的健壮枝条上，即完成杂种胚的挽救。嫁接后2～3年即可开花结果，极大缩短育种周期。
19.上述子叶败育杂种胚的挽救方法，步骤a中，采集杂交果的时间为授粉后50～60天。
20.上述子叶败育杂种胚的挽救方法，步骤b中，消毒处理方法为：先用体积分数为70％的酒精消毒30秒，然后用无菌水冲洗3～5次；再用质量浓度为1wt％的次氯酸钠溶液消毒30分钟，然后用无菌水冲洗3～5次。酒精消毒能力强，但是渗透力极强,消毒时间过长会将胚杀死，因此消毒时间不应超过30s；次氯酸钠消毒液高效、高速、广域、无毒、无害、无残留物污染，消毒后可以迅速分解，对环境没有危害。单独使用一种消毒液杀菌不彻底，两者相结合可以对种子进行有效的消毒同时保证胚的活性。
21.上述子叶败育杂种胚的挽救方法，步骤b中，初代培养基以改良ms(1/2 nh4no3)培养基为基本培养基，且初代培养基中6-苄氨基嘌呤的质量浓度为0.5mg/l，萘乙酸的质量浓度为0.5mg/l，琼脂的质量浓度为6g/l，蔗糖的质量浓度为30g/l；初代培养基的ph为5.8；初代培养的培养时间为7天；初代培养时，光照条件设置为2500lx，光照周期为16h/d。
22.上述子叶败育杂种胚的挽救方法，步骤c中，继代培养基以改良ms(1/2 nh4no3)培养基为基本培养基，且继代培养基中6-苄氨基嘌呤的质量浓度为0.5mg/l，二氯苯氧乙酸的质量浓度为0.5mg/l，琼脂的质量浓度为6g/l，蔗糖的质量浓度为30g/l；继代培养基的ph为5.8；继代培养的培养时间为20天；继代培养时，光照条件设置为1500lx，光照周期为8h/d。
23.本发明中所使用的改良ms(1/2 nh4no3)培养基的商品名称为ms培养基基盐(1/2 nh4no3，含维生素)，型号：pm1271，规格2
×
250g，生产厂家：北京酷来搏科技有限公司生产。
24.上述子叶败育杂种胚的挽救方法，步骤d中，壮苗培养基以改良ms(1/2 nh4no3)培养基为基本培养基，且壮苗培养基中玉米素的质量浓度为1.0mg/l，吲哚乙酸的质量浓度为0.1mg/l，琼脂的质量浓度为6g/l，蔗糖的质量浓度为30g/l；壮苗培养基的ph为5.8；壮苗培养的培养时间为30天；壮苗培养时，光照条件设置为1500lx，光照周期为8h/d。
25.上述子叶败育杂种胚的挽救方法，步骤e中，取健壮杂交苗上直径大于或等于0.5cm的健壮枝条嫁接到生长健壮的山杏树上直径在0.8～1.0cm的健壮枝条上。
26.本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
27.本发明使用高杂合度基因组的品种进行亲本配置，增加基因的融合性，提升种间、品种群间杂交亲和性。采用本发明的方法筛选得到的杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本能够有效提高杂交的亲和性，并通过胚挽救技术获得杂种苗，当年在大树上高位嫁接，提早开花结果，极大地推进了杏属植物优特异新品种创制进程。
28.本发明选取高杂合度亲本组合进行杏种、品种群间杂交，平均座果率达到7.03％(3.07～11.07％)，相比于两个低杂合度亲本平均座果率0.13％(0.00～0.25％)提高了53倍，显著提高品种群间杂交结实率。
29.授粉后50d左右，杂交种仁在子叶填充阶段容易出现败育现象，造成的杂交果提前脱落，极少数败育杂交果即使发育成熟，种子也干瘪失去活力，严重影响健康杂交种子的获得。本发明使用子叶败育胚挽救方法对50d左右成熟杂种胚进行离体培养，初代培养的成活率达到90％以上，继代培养增值系数为3～6个，壮苗培养后扩繁苗达到半木质化程度，经过嫁接生长健壮，当年即可少量花芽分化，2～3年就可结果，极大缩短了杂交育种进程。
附图说明
30.图1
‘
优一’杏的基因组杂合度的计算结果示意图(杂合度为1.32％)；
31.图2
‘
中仁5号’杏的基因组杂合度的计算结果示意图(杂合度为0.93％)；
32.图3
‘
珍珠油杏’的基因组杂合度的计算结果示意图(杂合度为1.20％)；
33.图4
‘
小白杏’的基因组杂合度的计算结果示意图(杂合度为1.30％)；
34.图5
‘
树上干’杏的基因组杂合度的计算结果示意图(杂合度为1.24％)；
35.图6
‘
金太阳’杏的基因组杂合度的计算结果示意图(杂合度为1.06％)；
36.图7西伯利亚杏(
‘
f106’)的基因组杂合度的计算结果示意图(杂合度为0.92％)；
37.图8
‘
龙王帽’杏的基因组杂合度的计算结果示意图(杂合度为1.36％)；
38.图9授粉后50d时，正常果(左)与败育果(右)的对比图；
39.图10授粉后50d时，正常果(左)与败育果(右)剖开后的对比图；
40.图11授粉后50d时，正常果(左)与败育果(右)的种仁对比图；
41.图12成熟时，正常果(左)与败育果(右)的对比图；
42.图13成熟时，正常果(左)与败育果(右)的种核剖开后的对比图；
43.图14成熟时，正常果(左)与败育果(右)的种仁对比图；
44.图15杂种胚挽救和成苗后嫁接流程图。
具体实施方式
45.(一)高亲和骨干亲本选择方法
46.本实施例中，杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本选择方法为：从杏属植物中选取性状优良的目标品种；计算目标品种的基因组杂合度；从目标品种中筛选出基因组杂合度大于或等于1％的杏属植物亲本即为杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本。
47.在本实施例中，为选择高亲和骨干亲本，对中国林业科学研究院经济林研究所孟州试验基地保存的新疆栽培杏(
‘
树上干’、
‘
小白杏’、
‘
珍珠油杏’)、普通杏(
‘
金太阳’)、山杏(
‘
中仁5号’)、西伯利亚杏(
‘
f106’)【西伯利亚杏
‘
f106’参见chen,c.,liu,h.,gou,n.et al.aprgpd:the apricot genomic and phenotypic database.plant methods 17,98(2021).】、仁用杏(
‘
优一’、
‘
龙王帽’)，共8个品种进行杂合度检测，进而选用高杂合度亲本进行杂交。
48.本实施中的新疆栽培杏、普通杏、山杏均属于普通杏(prunus armeniaca l.)的不同地理生态群(品种群)，品种群间存在较大性状差异，其中
‘
树上干’属于准格尔-伊利生态群伊利亚群，果实香甜，果仁兼优，抗寒性强；
‘
小白杏’、
‘
珍珠油杏’属于中亚细亚生态群库车亚群，果肉含糖量高，仁甜，果仁兼优；
‘
金太阳’属于欧洲生态群，果实极早熟，果肉酸甜可口；
‘
中仁5号’为普通的变种(prunus armeniaca var.ansu maxim.)，属于华北生态群华北亚群，丰产，种仁饱满，脂肪酸和蛋白质含量高。西伯利亚杏(prunus sibirica l.)具有种仁饱满、壳薄的特点，是重要苦杏仁资源。仁用杏品种
‘
优一’、
‘
龙王帽’为西伯利亚杏和普通杏自然种间杂种(prunus armeniaca
×
prunus sibirica)，仁大且甜，是重要甜杏仁资源。不同种、品种群之间的杂交有利于杏优良果、仁性状的聚合。
49.目标品种的基因组杂合度的计算方法为：
50.(1)分别选取上述不同品种的杏的幼嫩叶片进行dna提取；本实施例中dna的提取方法为ctab法；
51.(2)对提取得到的dna进行高通量测序，获得核苷酸序列数据经过质量控制后，得到序列文件；质量控制的目的是过滤掉低质量序列，质量控质的方法主要包括去掉reads的接头序列；截掉reads两端测序不准确的碱基；直接截取左端5个碱基，右端5个碱基；去除当中还含有n的reads；当一条reads中超过20％的碱基质量分数小于20，则舍弃该reads所对应的一对reads；
52.(3)利用kmc软件对序列文件进行k-mer的计数和统计，然后利用genome scope软件通过负二项式模型对k-mer数据进行拟合分析，计算得到基因组杂合度。本实施例中基因组杂合度的计算结果见图1至图8。
53.根据基因组杂合度的计算结果，设置“高杂合度与高杂合度、高杂合度与低杂合度、低杂合度与低杂合度”三种类型的杂交组合进行品种群间的远缘杂交，设置16个杂交组合(见表1)。根据最终获得杂交果数统计座果率，杂交果播种并统计出苗率，根据出苗种子数统计健康种子座果率。
54.(二)子叶败育杂种胚挽救方法
55.如图9至图14所示，杏品种群间的杂交果通常在子叶填充期(50左右)，胚已发育成熟，然而子叶填充出现问题导致大量杂交果败育脱落，极少量果实发育到成熟，种子也是干瘪状态。因而盛花后50d是胚挽救的关键时期。
56.本实施例中子叶败育杂种胚的挽救方法，包括如下步骤：
57.步骤a：在杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本授粉50～60d后，采集杂交果，并取出杂交果的种仁；杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本为利用上述基于基因组杂合度的杏属植物远缘杂交高亲和骨干亲本选择方法筛选得到的；
58.步骤b：在授粉采集杂交果实，取出种仁，使用体积分数为70％的酒精消毒30s，用无菌水冲洗3～5次；再用质量浓度为1wt％次氯酸钠溶液消毒30min，无菌水冲洗3～5次。接种方式筛选：采用去皮整个种子、剥开子叶的种子、分离出胚三种方式分别放入初代培养基中，结果显示三种方式的成活率分别为9.1％、26.1％以及92.6％，因此，分离出胚是最佳接种培养方式；
59.本实施例试验了三种基本培养基，并针对植物激素、ph和光照强度设置梯度，筛选杏杂种胚生长的最适培养基和培养条件。设置如下：基本培养基设置为wpm、ms、改良的ms(1/2 nh4no3)；6-苄氨基嘌呤(6-ba)设置浓度0.25mg/l、0.5mg/l、1mg/l；萘乙酸(naa)设置浓度0.2mg/l、0.5mg/l、0.8mg/l；二氯苯氧乙酸(2，4-d)设置浓度0.2mg/l、0.5mg/l、0.8mg/l；玉米素设置浓度0.5mg/l、1.0mg/l、2.0mg/l；吲哚乙酸(iaa)浓度设置0.05mg/l、0.1mg/l、0.15mg/l；光照组合1000lx、1500lx、2000lx；ph值设置梯度5.5、5.8、6.0；最后各配方加入蔗糖30g/l，琼脂6g/l，进行试验。最终确定最佳培养基如下，初代培养基：包括改良的ms(1/2nh4no3)，6-ba 0.5mg/l，naa 0.5mg/l，6g/l琼脂，30g/l蔗糖，ph 5.8，2500lx，光照周期16h/d。继代培养基：包括改良ms(1/2nh4no3)，6-ba 0.5mg/l，2,4-d 0.5mg/l，6g/l琼脂，30g/l蔗糖，ph 5.8，1500lx，光照周期12h/d。壮苗培养基：包括1/2ms(1/2nh4no3)，1.0mg/l玉米素，0.1mg/l iaa，6g/l琼脂，30g/l蔗糖，ph 5.8，1500lx，光照周期12h/d。本实施例中所使用的改良ms(1/2 nh4no3)培养基的商品名称为ms培养基基盐(1/2 nh4no3，含维生素)，型号：pm1271，规格2
×
250g，生产厂家：北京酷来搏科技有限公司生产。
60.步骤c：在杂种胚的上胚轴与下胚轴交界处横切后得到的两部分分别进行放入继代培养基中培养，得到扩繁植株；
61.步骤d：将扩繁植株分离并放置于壮苗培养基中培养，获得健壮杂种苗；
62.步骤e：取健壮杂交苗上直径大于或等于0.5cm的健壮枝条嫁接到杏树上直径在0.8～1.0cm的健壮枝条上高位嫁接，即完成杂种胚的挽救。嫁接后2～3年即可开花结果，极大缩短育种周期。
63.当6-ba浓度过低时对组培苗生长促进作用较小，过高时扩繁枝条过多，枝条细弱玻璃化率高；naa浓度过低时组培苗生长缓慢，过高易引起枝条褐化；2,4-d浓度过低时，继代苗生长弱小，浓度过高时则增殖系数降低；玉米素浓度过低，不利于木质化，达不到壮苗效果，浓度过高枝条畸形率上升；iaa浓度过低没有壮苗效果，过高会抑制其生长；ph值5.5时培养基凝固程度过低，ph值6.0时培养基凝固程度过高，均不利于组培苗的生长；光照过强不利于苗木的径向生长。
64.(三)杂交苗嫁接及管理
65.选取杂交组培苗0.5cm以上的枝条作为接穗，在6月中下旬，温度为20～25℃左右时进行嫁接，在晴朗无风天气，采用方块芽接方式进行嫁接。在接穗上切下长2～3cm、宽0.5～1cm的方块芽片，在砧木粗度为0.8～1.0cm的枝条切出与芽片大小相仿的表皮，并在切口下部割出1cm左右导流槽；将芽片放入切口，保持压片的一侧以及下部与砧木形成层紧密贴合，用薄膜包扎密封，露出芽体。嫁接前一周砧木浇透一次水，确保砧木水分充足，易离皮也利于嫁接口愈合分。嫁接口愈合完好(7天左右)，接芽萌动后，在距离嫁接口顶端1cm处剪砧，去掉包捆绑膜。接芽生长健壮后(20天左右)抹除砧木上多余芽，视情况喷施微量元素叶面肥以保证嫁接芽的茁壮生长。
66.(四)实施效果
67.本实施例基于亲本杂合度，分别设置“高杂合度与高杂合度、高杂合度与低杂合度、低杂合度与低杂合度”类型的品种群间杂交组合16个，试验在中国林业科学研究院经济林研究所孟州基地进行。杂交结果如表1所示，两个高杂合度亲本杂交的座果率为3.07～11.07％，平均7.03％；高杂合度与低杂合度亲本杂交座果率为1.18～2.50％，平均1.93％；两个低杂合度亲本间杂交的座果率为0.00～0.25％，平均0.13％。可见高杂合度有助于提高品种群间杂交亲和度和座果率。然而，由于子叶败育造成的杂交果提前脱落或者种子干瘪现象，健康种子少，两个高杂合度亲本杂交的健康种子座果率为0.00～2.79％，平均0.87％；高杂合度与低杂合度亲本健康种子座果率为0.00～0.50％，平均0.15％；两个低杂合度亲本间杂交的健康种子座果率均为0.00％。可见子叶败育造成的杂交果提前脱落或者种仁干瘪现象严重影响健康杂交种子的获得。
68.表1基于杂合度的杏品种群间杂交亲本配置及座果率
[0069][0070]
在子叶败育的关键时期(盛花后50d)，及时采集优一*金太阳杂交种子进行胚挽救。取杂交种仁，使用体积分数为70％酒精消毒30s，用无菌水冲洗3～5次，再用质量浓度为1wt％的次氯酸钠溶液消毒30min，用无菌水冲洗3～5次，用镊子、手术刀去除种皮，取出胚放入初代培养基培养7d，将上胚轴与下胚轴交界处横切分别进行继代培养20d，接着将扩繁的植株分离并放置壮苗培养基培养30d获得健壮杂交苗。在6月底，选取杂交组培苗直径0.5cm以上枝条作为接穗，采用方块芽接方式嫁接到生长健壮的山杏砧木0.8～1cm枝条上，
及时剪砧、抹芽、灌溉，获得生长健壮的植株，技术过程如图15所示。应用子叶败育胚挽救、嫁接技术，及时挽救杂交种子，并且迅速嫁接成苗，两年即可开花结果，有效缩短育种周期。
[0071]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。