一种pcr法检测人ercc1基因表达水平的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于ERCC1基因表达水平检测的试剂盒，采用荧光定量PCR平台，以TaqMan探针法，通过培养细胞保存的RNA作为外部校准RNA，以GapDH作为内对照基因归一化处理实验数据，对样本组织ERCC1基因mRNA的水平进行相对定量检测。该试剂盒能够在mRNA水平检测ERCC1的表达量，能够更真实反映其基因表达水平；荧光定量PCR方法检测数据由机器输出，杜绝人工主观判读，更加客观；使用培养的细胞作为外部RNA校准品，全过程同步荧光定量PCR实验，可以减少因实验过程造成的误差，使得临床cut-off值的确定成为可能，进而实现荧光定量PCR方法检测ERCC1基因mRNA水平在临床应用。
【专利说明】—种PCR法检测人ERCC1基因表达水平的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种用PCR法检测人ERCCl基因表达水平的试剂盒。
【背景技术】[0002]肺癌是最常见的恶性肿瘤，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌病例的75%-80%，多数病例在确诊时已属晚期，虽然钼类新药化疗是目前治疗晚期NSCLC的基本方案，但有效率亦仅为25%-30%，且肿瘤病人存在不同程度的异质性、对化疗的药物敏感性也不尽相同，故依据耐药基因及药敏选择药物化疗成为了国际趋势[4]。钼类抗癌药物与癌细胞DNA分子作用，形成药物-DNA分子配合物，破坏DNA，从而抑制癌细胞分裂。已有研究显示，核苷酸切除修复途径(NER)因具修复DNA的作用而与钼类耐药关系密切，其中关于ERCCl的研究较多，近年来发现ERCCl表达水平的高低与非小细胞肺癌的发病及预后都有紧密的关系。
[0003]ERCCl (excision repair cross complementationl,切除修复交叉互补基因 I)是核苷酸外切修复家族中的重要成员，ERCCl是重要的核苷酸外切修复酶之一，位于19号染色体上，编码297个氨基酸的蛋白，与XPF形成异源二聚体，在DNA单链受损处的5,端进行剪切而发挥功能。ERCCl的过表达可使停滞在G2/M期的损伤DNA迅速修复，导致其对顺钼耐药，ERCCl表达量直接影响DNA的修复，因此ERCCl可作为肿瘤细胞中药物-DNA结合物修复能力的检测标志。
[0004]Booton[32]等研究了低ERCCl水平与用钼类加吉西他滨治疗的非小细胞肺癌病人生存期之间的关系，结果表明相比高水平(20.4weeks, 95%confidence interval, 6.9 -33.9weeks)来说，低表达肿瘤患者的中位存活期明显更长(61.6weeks ；95%confidenceinterval，42.4 - 80.7weeks)。数据显示，ERCCl表达水平可以作为用CDDP (顺氨氯钼)治疗晚期NSCLC存活期的预测因子。Vi Imar [33]等研究了 443例NSCLC晚期病人，结果显不 ERCCl 阴性和 ERCCl 阳性的 Median overall survival (OS)分别是 11.8 和 9.8months,ERCCl蛋白表达为阴性的存活期比阳性表达者要长。Leng[34]和Roth[4]以及Pesta[35]的研究结果也与上述结果一致，表明ERCCl的mRNA在肿瘤组织中的表达可以用来预测NSCLC病人钼类药物的预后。研究者们除了对ERCCl和钼类药物疗效关系进行了研究[40]，也研究了该结果在个体化治疗中的效果[41]。Cobo[43]也根据ERCClmRNA的表达给予多西他赛加顺钼(低表达组)或多西他赛加吉西他滨(高表达组)化疗，对照组均给予多西他赛加顺钼化疗。结果显示，实验组(即低表达组和高表达组)客观缓解率(ORR)、无进展生存期(PFS)均高于对照组，表明ERCCl的表达可以预测化疗疗效。
[0005]现有的采用免疫组织化学方法检测ERCCl基因蛋白表达水平用于临床指导钼类药物的应用，由于免疫组织化学方法自身的缺陷，诸如:实验过程所受干扰因素多，结果判读受主观因素影响大等，以及蛋白水平不能准确反映基因实际表达水平，因此，新的能够准备检测ERCCl基因mRNA水平的方法是十分必需的。[0006]目前关于检测ERCCl表达的试剂盒的研究也在不断进行中，刘辉等曾报道过一种荧光定量PCR技术检测ERCClmRNA表达量的试剂盒的专利(申请号:201110032311.2)，选用了 β -actin作为参比基因，得到的表达量以SPSS统计分析高表达和低表达，并以免疫组化作为金标准与之比较，结果显示采用荧光定量PCR检测ERCClmRNA水平，检测结果的特异性和敏感度均显著提高，但是该专利对于PCR结果并未进行深入的截断值(cutoff值)分析等，降低了分析结果的准确性。邵琦等也曾发表ERCCl基因表达荧光定量PCR检测试剂盒的专利(申请号:201210333113.4)，但是该专利中并未运用外部校准品法检测ERCCl基因表达。
[0007]上述研究报道说明ERCCl的表达与肺癌预后及钼类化疗耐药有关，在早期术后患者中ERCCl高表达者生存时间显著延长，预后好。而在接受钼类化疗的晚期NSCLC患者中，ERCCl阳性表达者反而较阴性者预后差，ERCCl阴性者无病生存期及总的生存期较阳性者明显延长，可作为指导预后的独立预测指标。但目前关于检测ERCCl基因表达的试剂盒均没有采用RNA校准品，不能在不同次或不同实验室中减少实验误差，无法获得各实验间的相互比较。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种能有效、快速、准确地检测组织中的ERCCl基因表达水平的试剂盒。使用T47D细胞作为外部RNA校准品，全过程同步荧光定量PCR实验，可以减少因实验过程造成的误差，并且数据归一化处理后，各次/组测量或各种实验条件下的测量可以实现相互比较，消除测量间的非实验差异，使得临床cut-off值的确定成为可能，进而实现荧光定量PCR方法检测ERCCl基因mRNA水平在临床应用使得我们的结果更完善，更准确，更利于为病人提供可靠的预测信息。
[0009]具体的技术方案是:
[0010]一种PCR法检测人ERCCl基因表达水平的试剂盒，包括有扩增人的ERCCl基因对应的引物、GAPDH内参基因对应的引物，其特征在于:还包括有校准品人乳腺癌细胞株T47D。
[0011]本发明所述的人乳腺癌细胞株T47D名称T47D-KBLUC (ATCC:emoj1: CRL-2865: trademark:),购自ATCC (美国标准生物品收藏中心)。
[0012]本发明提供的人ERCCl基因表达水平的试剂盒，是通过real-time PCR扩增方法对所述的基因表达水平进行测定的，根据f法计算出ERCCl基因的相对表达量，以GAPDH基因作为内参基因。在使用过程中，是以目标样本和校准品T47D细胞中ERCCl基因的相对表达水平作为评判标准。
[0013]本发明对校准品细胞筛选的原则是ERCCl表达、内参基因(GAPDH)表达水平相对恒定；免疫细胞化学结果、原位细胞杂交结果的阳性水平一致。
[0014]进一步地，所述的扩增人的ERCCl基因对应的引物是指:
[0015]ERCCl 上游引物:5' -GAAGGACAAACGGGGGGT-3' (SEQ ID N0.1)
[0016]ERCCl 下游引物:5' -AGTGGGTAGCTCTGTGT-3' (SEQ ID N0.2)
[0017]进一步地，所述的扩增GAPDH内参基因对应的引物是指:
[0018]GAPDH 上游引物:5' -GAAGGTGCAAGGTCGGAGT-3' (SEQ ID N0.3)[0019]GAPDH 下游引物:5' -GAAGATGGTAGCTGGGATTTC-3' (SEQ ID N0.4)
[0020]进一步地，所述的试剂盒中还包括有ERCCl基因和GAPDH基因所对应的荧光探针。
[0021]进一步地，所述的ERCCl基因的荧光探针是指:
[0022]5' -AATTTCTTCCCTGCTGGCGGCCC-3' (SEQ ID N0.5)
[0023]进一步的，所述的GAPDH基因所对应的突光探针是指:
[0024]5' -CAAGCTTCCCAGTCTCAGCC-3' (SEQ ID N0.6)
[0025]进一步的，所述的荧光探针的5’端是用FAM进行标记的。
[0026]进一步的，所述的荧光探针的3’端是用BHQl进行标记的。
[0027]进一步的，上述的试剂盒中引物和反应混合物的组成是:
[0028]ERCCl弓丨物:上、下游引物各200nM
[0029]ERCCl 探针:200nM
[0030]GAPDH引物:上、下游引物各200nM
[0031]GAPDH 探针:200nM
[0032]2 X反应液,包括有:`
[0033]
DNA 聚論:2-4U
Mg2+6.0-10.0mM
buffer2*PCRbuiler ΙμΙ
d\ I P400--M-MiOuM
SdH2O补足苹20μ?
[0034]
[0035]进一步的，上述的试剂盒中还包括有阳性对照和阴性对照。阳性对照可以采用的是以含ERCCl基因的重组质粒代替模板，阴性对照可以采用不含ERCCl模板，如dd H2O0
[0036]本试剂盒的使用方法是:
[0037]首先获取目标组织样本，用石蜡组织RNA提取试剂盒提取RNA并反转录成cDNA，然后配制PCR反应液进行荧光定量PCR ；
[0038]PCR 扩增程序是:95°C IOmin, 95°C 15s,60°C lmin,循环 40 次；
[0039]依同法，对校准品细胞T47D进行RNA提取、反转录，再进行PCR扩增；
[0040]反应结束后从荧光定量PCR仪中读取Ct值，ERCCl和GAPDH两者Ct值之差即为Λ Ct值，目标组织和校准品细胞T47D之间的Λ Ct值之差即为Λ Λ Ct值，计算出2_Δ Δα值。
[0041]目标组织样本可以是非小细胞肺癌肿瘤组织。
[0042]有益效果
[0043](I)敏感性:PCR方法可以对微量的样本进行有效扩增，从而进行检测；
[0044](2)特异性:以特异性引物进行PCR扩增反应，使用Taqman探针法进行相对定量，具有很高的特异性性；
[0045](3)相对定量客观:本发明引入了外部校准品，以标准细胞作为外部校准RNA的保存介质，同步PCR反应全程，可以减少因实验过程造成的误差，并且数据归一化处理后，各次/组测量或各种实验条件下的测量可以实现相互比较，消除测量间的非实验差异，使得临床cut-off值的确定成为可能，进而实现荧光定量PCR方法检测ERCCl基因mRNA水平在临床应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0046]图1A是ERCCl基因的Ct和样本浓度的关系图；
[0047]图1B是GAPD基因的Ct和样本浓度的关系图；
[0048]图2A是正常组织ERCCl扩增曲线图
[0049]图2B是正常组织GAPDH扩增曲线图
[0050]图2C是癌组织ERCCl扩增曲线图[0051 ]图2D是癌组织GAPDH扩增曲线图
【具体实施方式】[0052]实施例1校准品细胞的确定
[0053]I细胞的活化和培养方法:
[0054]用T25瓶培养备选的标准细胞株，例如:人乳腺癌细胞株T47D，人乳腺癌细胞株MCF-7、人非小细胞肺癌细胞株A549、人结肠癌细胞细胞株Lovo等细胞，培养基用1640。
[0055]每天观看细胞生长状况，若培养基颜色变黄，做如下处理:吸去旧培养基用3ml左右的PBS冲洗细胞一次，轻轻摇晃后吸掉PBS，吸取1640培养基5ml于T25瓶中，轻轻摇匀，继续培养于37 °C，5%C02培养箱中(一般I-2天更换一次培养液)；
[0056]观察细胞生长状况，若细胞长满90%-100%，做如下处理:吸去旧培养基，用3ml左右PBS冲洗培养瓶中，轻轻摇晃后吸掉PBS，加入Iml胰酶，放入37°C，5%C02培养箱中消化2-3min，待细胞变圆，触角消失，镜下观察后，稍用力敲击瓶皿，使细胞脱落。吸取Iml 1640培养基(含胎牛血清)终止消化,并吹打,吹散细胞,将所有细胞悬液于离心管中,封口后放入离心机中，1200rpm/3min离心结束后弃上清,最后在上述细胞沉淀中加入Iml RNA Later并重悬，于-80°C保存。
[0057]2校准品细胞的确定原则
[0058]培养细胞，获得符合要求的足量细胞，加入RNA Later制成细胞悬液，作为校准品。
[0059]按照下述选择要求选择细胞系:(1)细胞系中有目的基因、参照基因相对恒定表达；⑵细胞系处于可获得状态，且可溯源(如最初分离建立细胞系的机构，在不同机构内引进和传代的经过、已传代数，细胞保存状态等。)；⑶细胞培养难度低，容易获得大量细胞。
[0060]检测培养细胞的ERCCl基因和内参基因(GAPDH)的表达，用荧光定量PCR检测RNA水平。细胞系选择、细胞代数选择判断标准:⑴基因表达恒定同一细胞系，不同代间ERCCl表达、内参基因(GAPDH)表达水平相对恒定，每代细胞的ERCCl基因和内参基因荧光定量结果显示不同代间mRNA水平无显著差异。
[0061]经过大量试验摸索，一些标准细胞会出现培养后细胞形态变化较大，生长差缓慢，产量低下的问题，例如:非小细胞肺癌细胞株A549和人结肠癌细胞细胞株Lovo等。另外，有一些标准细胞的目的基因与内参基因的扩增效率不同，导致不适合采用相对表达量进行测定。另外，一些细胞在经过培养之后，会出现目的基因表达量过低或者是目的基因表达非常不稳定的问题，例如:在第五代时发现MCF-7细胞的ERCCl基因的表达不稳定，并且呈明显下降趋势，因而弃之。
[0062]例如:对MCF-7细胞进行实时荧光PCR扩增，共进行5次重复试验，每次同时在3个孔板中进行反应，扩增反应Ct值如表I所示。可以看出，MCF-7细胞的Ct值远远大于内参基因的Ct值，其表达量非常低；另外，根据14次有效试验的数据的相对标准偏差是56.4%，表达非常不稳定，故不适合于作为校准品。
[0063]表1MCF-7的扩增Ct值
[0064]
【权利要求】
1.一种PCR法检测人ERCCl基因表达水平的试剂盒，包括有扩增人的ERCCl基因对应的引物、GAPDH内参基因对应的引物，其特征在于:还包括有校准品人乳腺癌细胞T47D。
2.根据权利要求1所述的PCR法检测人ERCCl基因表达水平的试剂盒，其特征在于: 所述的人的ERCCl基因对应的引物是指: ERCCl 上游引物:5’ -GAAGGACAAACGGGGGGT-3’ ERCCl 下游引物:5’ -AGTGGGTAGCTCTGTGT-3’ 所述的GAPDH内参基因对应的引物是指: GAPDH 上游引物:5’ -GAAGGTGCAAGGTCGGAGT-3’ GAPDH 下游引物:5’ -GAAGATGGTAGCTGGGATTTC-3’。
3.根据权利要求1所述的PCR法检测人ERCCl基因表达水平的试剂盒，其特征在于:所述的试剂盒中还包括有ERCCl基因和GAPDH基因所对应的荧光探针。
4.根据权利要求3所述的PCR法检测人ERCCl基因表达水平的试剂盒，其特征在于:所述的ERCCl基因的荧光探针是指:
5’-AATTTCTTCCCTGCTGGCGGCCC-3’ 所述的GAPDH基因所对应的荧光探针是指:
5’-CAAGCTTCCCAGTCTCAGCC-3’ 。
5.根据权利要求4所述的PCR法检测人ERCCl基因表达水平的试剂盒，其特征在于:所述的荧光探针的5’端是用FAM进行标记的，荧光探针的3’端是用BHQl进行标记的。
6.根据权利要求1所述的PCR法检测人ERCCl基因表达水平的试剂盒，其特征在于:试剂盒中引物和反应混合物的组成是: ERCCl引物:上、下游引物各200 nM ERCCl 探针:200 nM GAPDH引物:上、下游引物各200 nM GAPDH 探针:200 nM 2X反应液，包括有: DNA聚合酶 2-4U Mg2+ 6.0-10.0mM buffer 2*PCR buffer I μ L dNTP 400uM-600uM SdH2O 补足至 20 μ L。
7.根据权利要求1所述的PCR法检测人ERCCl基因表达水平的试剂盒，其特征在于:所述的试剂盒中还包括有:阳性对照和阴性对照。
8.根据权利要求7所述的PCR法检测人ERCCl基因表达水平的试剂盒，其特征在于:所述的阳性对照是含ERCCl基因的重组质粒代替模板，阴性对照是dd H2O0
【文档编号】G01N21/64GK103451303SQ201310416741
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】凌晓光, 狄峰, 蒋雅丽 申请人:江苏康克生物技术有限公司