专利名称：膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及表观遗传学研究领域，尤其是涉及一种膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法及应用。
背景技术：
膜性肾病是以基底膜弥漫性增厚及上皮下免疫复合物沉积为特征，肾小球也表现出独特的形态学特征:比如，基底膜增厚、颗粒状IgG在肾小球毛细血管袢沉积或呈电子致密物沉积在上皮下组织。膜性肾病发生在世界各地，没有种族、年龄及性别的差异。目前为止，也有不少关于膜性肾病发病机制的研究，但是仍没有找到膜性肾病特异性的生物标志物。迄今为止，膜性肾病的组蛋白甲基化状态改变也不清楚。
对膜性肾病(丽)的发病机制中所涉及的细胞和分子层面的理解来自对大鼠Heymann肾炎模型的研究，这个模型与人类MN的临床及病理特点非常类似。大量的文献证实有不少关于人类MN的发病机制的研究，但是MN的特异生物标志物仍然没有找到。发明内容
基于此，有必要提供一种用于研究膜性肾病特异性生物标志物的膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法及应用。
一种膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法，包括如下步骤:
分别采集膜性肾病患者和健康对照组的外周血单个核细胞；
室温下使用1%的甲醛溶液分别对所述外周血单个核细胞进行交联处理，然后用PBS溶液进行洗涤，再加入IM的甘氨酸溶液终止交联；
分别收集交联后的外周血单个核细胞，用匀浆器进行处理裂解细胞核，收集裂解物后溶解悬浮于缓冲液中，使用H3K9三甲基化(H3K9me3)抗体沉淀所述缓冲液中的裂解物，得到的DNA与抗体的复合物用蛋白酶K于65°C处理后得到纯化的DNA片段；
使用Illumina样品准备包对所述纯化的DNA片段进行末端修复、添加接头和片段大小选择处理，选择除去接头后大小为IOObp的DNA片段进行测序，将测序得到的序列与bosTau数据库的参考基因组进行比对，允许两个碱基的错配，删除不能比对到参考基因组的序列，然后使用MACS法 对比对后的序列进行分析确定转录因子的结合位点、ChlP-seq数据集以及H3K9三甲基化对应的DNA富集区，使用MEME软件对MACS法的分析结果进行处理得到新的与H3K9三甲基化对应的DNA模体，并依据所述DNA模体找到与H3K9三甲基化相关的基因；以及
对比膜性肾病患者和健康对照组的所述H3K9三甲基化相关的基因得到所述膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因。
在其中一个实施例中,所述测序过程使用的是Solexa/Illumina2G测序仪对除去接头后大小为IOObp的DNA片段进行测序。
在其中一个实施例中，所述将测序得到的序列与bosTau数据库的参考基因组进行比对是使用短读对准仪Bowtie将测序得到序列与bosTau数据库的参考基因组进行比对。
在其中一个实施例中，所述使用MACS法对比对后的序列进行分析过程中MACS参数为:带宽为273 ;基因组大小为2.70e+09 ;标签大小为49 ;模型折叠数据是10，30 ；p值为1.00e_05o
上述膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法通过使用染色质免疫沉淀-高通量(ChlP-seq)测序来分析膜性肾病患者外周血单个核细胞(PBMCs)的组蛋白H3K9三甲基化状态的改变，得到膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因，深入研究这些差异表达基因将有助于进一步阐明膜性肾病的发病机理，为膜性肾病的诊断和治疗提供新途径。上述膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法设计合理可行，能够有效地协助建立一种膜性肾病差异表达基因的图谱模型，获取作为中间结果的膜性肾病的相关信息。
一种基因检测芯片，所述基因检测芯片上固定有上述方法得到的膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因。
在其中一个实施例中，所述差异表达基因为DGCR6、SNX16、CNTN4、BIRC2及BIRC3中的至少一种。
通过上述基因检测芯片，可以为初步诊断膜性肾病提供中间结果信息，检测过程方便，不需要使用传统的繁杂的检测步骤，但由于膜性肾病往往是一种综合病征，获取这些中间结果之后还需要结合其他检测数据才能诊断为是否是膜性肾病。
图1为H3K9三甲基化多个富集区(peaks)的分布，其中横轴代表富集区的长度，纵轴代表富集区的数目；
图2为富集区相关基因在全基因组内的分布；
图3为富集区相关基因GO分析结果图，其中，横轴代表GO项，左纵轴代表与GO相关的基因比例，右纵轴代表与GO相关的基因数量；
图4为DNA motif的示意图,其中，横轴表示该motif的位点,纵轴总的高度反应该motif的保守性，每个碱基的高度代表该碱基出现的频率。
具体实施方式
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下面主要结合附图及具体实施例对膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法及应用做进一步详细的说明。
一实施方式的膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法，包括如下步骤:
步骤SllO:分别采集膜性肾病患者和健康对照组的外周血单个核细胞。
步骤S120:室温下使用1%的甲醛溶液分别对外周血单个核细胞进行交联处理，然后用PBS溶液进行洗涤，再加入IM的甘氨酸溶液终止交联。
步骤S130:分别收集交联后的外周血单个核细胞，用匀浆器进行处理裂解细胞核，收集裂解物后溶解悬浮于缓冲液中，使用H3K9三甲基化抗体沉淀缓冲液中的裂解物，得到的DNA与抗体的复合物用蛋白酶K于65°C处理后得到纯化的DNA片段。
步骤S140:使用Illumina样品准备包(Illumina公司产品)对纯化的DNA片段进行末端修复、添加接头和片段大小选择处理，选择除去接头后大小为IOObp的DNA片段进行测序，将测序得到的序列与bosTau数据库的参考基因组进行比对，允许两个碱基的错配，删除不能比对到参考基因组的序列，然后使用MACS法对比对后的序列进行分析确定转录因子的结合位点、ChlP-seq数据集以及H3K9三甲基化对应的DNA富集区，使用MEME软件对MACS法的分析结果进行处理得到新的与H3K9三甲基化对应的DNA模体，并依据DNA模体找到与H3K9三甲基化相关的基因。
其中，测序过程使用的是Solexa/Illumina2G测序仪对除去接头后大小为IOObp的DNA片段进行测序。将测序得到的序列与bosTau数据库的参考基因组进行比对是使用短读对准仪Bowtie将测序得到序列与bosTau数据库的参考基因组进行比对。使用MACS法对比对后的序列进行分析过程中MACS参数为:带宽为273 ;基因组大小(genome size)为2.70e+09 ;标签大小(tag size)为49 ;模型折叠数据(model fold)是10，30cutoff)为 1.00e-05。
步骤S150:对比膜性肾病患者和健康对照组的H3K9三甲基化相关的基因得到膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因。
具体在本实施方式中得到5个较大差异表达的基因，分别是表达上调的DGCR6、SNX16、CNTN4和BIRC2，以及一个表达下调的BIRC3。
上述膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法通过使用染色质免疫沉淀-高通量测序(ChlP-seq)来分析膜性肾病患者外周血单个核细胞(PBMCs)的组蛋白H3K9三甲基化状态的改变，得到膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因，深入研究这些差异表达基因水平将有助于进一步阐明膜性肾病的发病机理，为膜性肾病的诊断和治疗提供新途径。上述膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法设计合理可行，能够有效地协助建立一种膜性肾病差异表达基因的图谱模型，获取作为中间结果的膜性肾病的相关信肩、O
此外，本实施方式还提供了一种基因检测芯片，在该基因检测芯片上固定有上述方法得到的膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因作为检测探针。
优选的，上述差异表达基因为DGCR6、SNX16、CNTN4、BIRC2及BIRC3中的至少一种。
通过上述基因检测芯片可以检测待测患者的相关基因的表达水平，获得初步诊断膜性肾病提供中间结果信息，检测过程方便，不需要使用传统的繁杂的检测步骤，但由于膜性肾病往往是一种综合病征，获取这些中间结果之后还需要结合其他检测数据才能诊断为是否是膜性肾病。
以下为具体实施例部分:
1.材料与方法
1.1样本的采集
本实施例共有20个样本，见表I，其中， 疾病组10人，健康对照组10人。疾病组患者来源于桂林市第181医院肾脏科，是经肾活检确诊为膜性肾病的患者，并且排除了炎症、糖尿病及其他疾病的干扰。健康对照组与疾病组年龄、种族、性别相匹配。本研究征得了桂林市第181医院伦理委员会的同意。
表I疾病组和对照组的人口学和临床特征
权利要求
1.一种膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法，其特征在于，包括如下步骤: 分别采集膜性肾病患者和健康对照组的外周血单个核细胞； 室温下使用1%的甲醛溶液分别对所述外周血单个核细胞进行交联处理，然后用PBS溶液进行洗涤，再加入IM的甘氨酸溶液终止交联； 分别收集交联后的外周血单个核细胞，用匀浆器进行处理裂解细胞核，收集裂解物后溶解悬浮于缓冲液中，使用H3K9三甲基化抗体沉淀所述缓冲液中的裂解物，得到的DNA与抗体的复合物用蛋白酶K于65°C处理后得到纯化的DNA片段； 使用Illumina样品准备包对所述纯化的DNA片段进行末端修复、添加接头和片段大小选择处理，选择除去接头后大小为IOObp的DNA片段进行测序，将测序得到的序列与bosTau数据库的参考基因组进行比对，允许两个碱基的错配，删除不能比对到参考基因组的序列，然后使用MACS法对比对后的序列进行分析确定转录因子的结合位点、ChlP-seq数据集以及H3K9三甲基化对应的DNA富集区，使用MEME软件对MACS法的分析结果进行处理得到新的与H3K9三甲基化对应的DNA模体，并依据所述DNA模体找到与H3K9三甲基化相关的基因；以及 对比膜性肾病患者和健康对照组的所述与H3K9三甲基化相关的基因得到所述膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因。
2.如权利要求1所述的膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法，其特征在于，所述测序过程使用的是Solexa/Illumina2G测序仪对除去接头后大小为IOObp的DNA片段进行测序。
3.如权利要求1所述的膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法，其特征在于，所述将测序得到的序列与bosTau数据库的参考基因组进行比对是使用短读对准仪Bowtie将测序得到序列与bosTau数据库的参考基因组进行比对。
4.如权利要求1所述的膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法，其特征在于，所述使用MACS法对比对后的序列进行分析过程中MACS参数为:带宽为273 ;基因组大小为2.70e+09 ;标签大小为49 ;模型折叠数据是10，30 ；p值为1.00e-05。
5.一种基因检测芯片，其特征在于，所述基因检测芯片上固定有如权利要求1 4中任一项所述的方法得到的膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因。
6.如权利要求5所述的基因检测芯片，其特征在于，所述差异表达基因为DGCR6、SNX16、CNTN4、BIRC2 及 BIRC3 中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法，其通过使用染色质免疫沉淀-高通量(ChIP-seq)测序来分析膜性肾病患者外周血单个核细胞(PBMCs)的组蛋白H3K9三甲基化状态的改变，得到膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因，深入研究这些差异表达基因将有助于进一步阐明膜性肾病的发病机理，为膜性肾病的诊断和治疗提供新途径。上述膜性肾病三甲基化状态的差异表达基因的分析方法设计合理可行，能够有效地协助建立一种膜性肾病差异表达基因的图谱模型，获取作为中间结果的膜性肾病的相关信息。
文档编号C40B40/08GK103205490SQ201310076679
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月11日 优先权日2013年3月11日
发明者眭维国, 戴勇, 何慧燕 申请人:眭维国